隨著疫情防控態(tài)勢(shì)逐漸趨穩(wěn),社會(huì)生產(chǎn)生活正常秩序逐漸恢復(fù),如何讓每一個(gè)有需要的人都能夠得到方便、快捷、靈敏的新冠病毒核酸檢測(cè),對(duì)當(dāng)前疫情防控和復(fù)產(chǎn)復(fù)工復(fù)學(xué)具有極為重要的意義。
日前,清華大學(xué)藥學(xué)院白凈衛(wèi)、李寅青與醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系劉鵬課題組在北京市科委和清華大學(xué)自主研發(fā)計(jì)劃支持下聯(lián)合研發(fā)出一體化自助式SARS-CoV-2核酸檢測(cè)卡盒(BINAS),在解決以上問題上取得重大突破。該卡盒具有居家檢測(cè)的便捷性,兩個(gè)推桿一推一拉之間,30分鐘內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)“樣本入、結(jié)果出”!
自疫情發(fā)生以來,清華大學(xué)高度重視,全力開展各項(xiàng)攻關(guān)工作。藥學(xué)院積極響應(yīng)、迅速組織科研攻關(guān)團(tuán)隊(duì)。此次核酸檢測(cè)卡盒的問世,無疑是藥學(xué)院在抗“疫”工作方面進(jìn)入了又一個(gè)令人欣喜且值得期待的全新階段。
原理:弄清病毒“身份證”
這些技術(shù)難關(guān)是如何突破的呢?在回答這個(gè)問題前,首先需要科普一下核酸檢測(cè)到底是什么,以及為什么它能準(zhǔn)確地檢出新冠病毒。核酸是核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)的總稱,也就是我們常說的RNA和DNA,是生物體遺傳信息的總和。
核酸就好比一張?jiān)O(shè)計(jì)圖紙,沒有它就永遠(yuǎn)蓋不好一座大樓。
現(xiàn)在常用的檢測(cè)方式如熒光PCR法(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)),便是利用PCR可以在生物體外擴(kuò)增特定的DNA片段,從而達(dá)到檢測(cè)的目的。
換句話說,待測(cè)樣品(疑似病人試樣)就好比一個(gè)陌生人,我們不知道他是誰,但他有一張獨(dú)一無二的“身份證”——目標(biāo)DNA。我們利用PCR法不但可以看到他的“身份證”,還可以擴(kuò)增復(fù)制很多張,從而利用熒光檢測(cè)來確定他到底是誰!
這個(gè)過程說來簡(jiǎn)單,但實(shí)際操作并不容易。
核酸檢測(cè)并不像曼妥思糖丟入汽水時(shí)瞬間劇烈反應(yīng),也不像硫酸銅滴入氫氧化鈉會(huì)出現(xiàn)明顯的陽性反應(yīng),所以以往的核酸檢測(cè)往往需要在嚴(yán)苛的實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件和專業(yè)的設(shè)備下,經(jīng)過2-3小時(shí)的繁瑣操作和反應(yīng)才能得到檢測(cè)結(jié)果。而且,在取樣過程中非常容易受到雜質(zhì)的影響,從而導(dǎo)致核酸提取的損失,受實(shí)驗(yàn)條件的影響還會(huì)導(dǎo)致樣本擴(kuò)增倍率低,最終經(jīng)常導(dǎo)致“假陰性”情況出現(xiàn)。
劉鵬(左),白凈衛(wèi)(中),李寅青(右)
而清華大學(xué)白凈衛(wèi)、李寅青、劉鵬團(tuán)隊(duì),正是克服了以往核酸檢測(cè)對(duì)時(shí)間、條件和靈敏度的苛刻要求,實(shí)現(xiàn)了從咽拭子取樣、一體化卡盒反應(yīng)、膠體金試紙條讀取的自助操作,在保證準(zhǔn)確率的前提下,30分鐘內(nèi)即可出結(jié)果!
一體化卡盒的基本流程快速:把耐力跑變成接力跑
“時(shí)間提速是我們這次做核酸檢測(cè)要解決的最大難題!”白凈衛(wèi)此前長期從事基因測(cè)序技術(shù)的研究,積累了豐富的核酸樣本采集、處理、檢測(cè)的經(jīng)驗(yàn)。他介紹,核酸檢測(cè)PCR法利用傳統(tǒng)的方式讓樣品擴(kuò)增,一開始樣品復(fù)制很快,但后期速度就遞減,耗時(shí)太長。
“我們?cè)诩夹g(shù)攻關(guān)中,采用了巢式等溫?cái)U(kuò)增(ITA)技術(shù)。”白凈衛(wèi)表示。
所謂的“巢式”,可以理解為 “嵌套”,一個(gè)環(huán)節(jié)嵌套一個(gè)環(huán)節(jié)。白凈衛(wèi)把新冠檢測(cè)這類恒量核酸樣本的擴(kuò)增的過程比喻為“運(yùn)動(dòng)員長跑”,運(yùn)動(dòng)員一開始速度很快,但是往往耐力不足。樣品擴(kuò)增也是如此,一開始復(fù)制很快,但中途就衰減下來,所以為了提高速度,他們把“長跑”改成 “接力跑”,可以在短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)個(gè)位數(shù)的新冠病毒進(jìn)行檢測(cè)。
“最后,以上反應(yīng)物在膠體金試紙上通過競(jìng)爭(zhēng)法顯色,讀取方式與驗(yàn)孕棒類似,一目了然?!?白凈衛(wèi)說,整個(gè)過程理論上22分鐘即可完成,檢測(cè)者個(gè)人操作的話,30分鐘之內(nèi)完全可以實(shí)現(xiàn)“樣本入,結(jié)果出”。
靈敏:時(shí)間允許條件下樣本準(zhǔn)確率近100%
藥學(xué)院李寅青長期從事 CRISPR 技術(shù)和微量核酸處理技術(shù)的研發(fā),積累了豐富的樣本處理、核酸擴(kuò)增和檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)。在核心檢測(cè)技術(shù)研發(fā)上,他與白凈衛(wèi)緊密配合。
為了克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法出現(xiàn)“假陰性高”問題,李寅青表示,他們?cè)跇颖精@取、核酸擴(kuò)增、病原識(shí)別、膠體金免疫層析顯色等環(huán)節(jié),都進(jìn)行了整合簡(jiǎn)化,減少檢驗(yàn)人員的干預(yù),提升檢測(cè)的靈敏度。
共同探討研究思路
“比如在簡(jiǎn)化樣本處理方面,由于咽拭子樣本通常含有抑制反應(yīng)的雜質(zhì),常規(guī)檢測(cè)樣本通常需要經(jīng)過核酸提取過程,這個(gè)流程費(fèi)時(shí)且人工操作相對(duì)復(fù)雜,不適合未經(jīng)培訓(xùn)的人員使用?!崩钜嗾f,他們通過優(yōu)化裂解流程和后端擴(kuò)增試劑,實(shí)現(xiàn)不經(jīng)過核酸提取直接進(jìn)入反轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增的流程,極大的降低檢測(cè)過程復(fù)雜性,減少了因雜質(zhì)導(dǎo)致的“假陰性”案例。
李寅青介紹,他們用新研發(fā)的技術(shù)對(duì)19 例 QPCR(傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法)陽性患者樣本進(jìn)行了復(fù)合,結(jié)果全部可以檢出。
“結(jié)果證明了本項(xiàng)目的靈敏度接近QPCR的靈敏程度,QPCR是300 拷貝/毫升(copies/ml),我們的靈敏度小于400拷貝/毫升。此外,與近期于國際頂級(jí)期刊 Nature Biotechnology 報(bào)道的美國加州基于CRISPR原理開發(fā)的高靈敏度技術(shù)相比,本項(xiàng)目獨(dú)創(chuàng)的帶標(biāo)簽的巢式等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)時(shí)間更短靈敏度更高?!崩钜啾硎?。
便捷:一推一拉搞出結(jié)果
如果說白凈衛(wèi)與李寅青主要的工作是開發(fā)檢測(cè)軟件,那么醫(yī)學(xué)院劉鵬所承擔(dān)的任務(wù)就是研發(fā)硬件——“檢測(cè)盒”。
劉鵬在醫(yī)學(xué)院生醫(yī)系一直從事微流控與生物芯片方面的研究工作。“這個(gè)項(xiàng)目最初的想法就是實(shí)現(xiàn)居家使用,形狀要便攜,性能要集成。藥學(xué)院項(xiàng)目組前期的開發(fā)的檢測(cè)試劑靈敏度高,速度快,受雜質(zhì)干擾小,恒溫檢測(cè)對(duì)溫控要求低,這些都為卡盒一體化集成提供了有利前提?!彼岬健凹伞钡母拍睿鞍褭z測(cè)環(huán)節(jié)都集中一個(gè)卡盒上,通過精密的流體控制,達(dá)到高靈敏度的檢測(cè)效果?!?br>
劉鵬介紹,以上操作和試劑將由“一體集成化微流控卡盒”承載:第一步,移動(dòng)桿帶動(dòng)注射器式的活塞導(dǎo)致裂解的樣品流入第一個(gè)等溫?cái)U(kuò)增腔;第二步,反應(yīng)10 分鐘后,反應(yīng)產(chǎn)物被稀釋;第三步,泵入第二個(gè)等溫反應(yīng)室進(jìn)行帶探針的進(jìn)一步擴(kuò)增;最后,將反應(yīng)混合物泵入裝有層流試紙條的室中,以讀出測(cè)試結(jié)果。這其中,卡盒含有 USB 或電池供電的簡(jiǎn)易恒溫電路,可以提供擴(kuò)增反應(yīng)所需要的溫度。
由美術(shù)學(xué)院趙超教授完成的卡盒外觀設(shè)計(jì)成品
“為提高卡盒的用戶使用體驗(yàn),我們邀請(qǐng)了清華美院副院長趙超教授對(duì)卡盒進(jìn)行結(jié)構(gòu)和外觀設(shè)計(jì),趙老師從用戶操作和體驗(yàn)等多個(gè)角度對(duì)卡盒的定型提供了非常大的幫助,預(yù)計(jì)未來的卡盒長寬高約為10x10x3cm,檢測(cè)者使用時(shí)只要把兩個(gè)推桿上下各一推,30分鐘內(nèi)就可以查看結(jié)果,操作非常簡(jiǎn)單?!?劉鵬表示,根據(jù)他們的設(shè)想,未來還將進(jìn)行批量化檢測(cè)卡盒研發(fā),進(jìn)行多樣本檢測(cè),并將開發(fā)移動(dòng)端 APP,輔助用戶使用和結(jié)果判讀。
操作卡盒中
據(jù)悉,下一步,該項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)將推進(jìn)小批量卡盒裝配,驗(yàn)證批量化生產(chǎn)的可行性,同時(shí)與醫(yī)院合作,加快臨床樣本的驗(yàn)證。目前,團(tuán)隊(duì)也正在積極尋找未來的合作伙伴,加快檢測(cè)卡盒的報(bào)批工作。
研發(fā):沒有想太多,只想做點(diǎn)事
白凈衛(wèi)、李寅青、劉鵬,三人在清華的經(jīng)歷非常相似,都是70后或80后,都有留美科研經(jīng)歷,科研興趣相近,平時(shí)交流很多。
今年春節(jié),“武漢封城”的消息讓三人坐立不安。當(dāng)時(shí),他們不約而同搜索了領(lǐng)域內(nèi)的相關(guān)論文并咨詢了戰(zhàn)斗在抗疫一線的醫(yī)護(hù)工作者,發(fā)現(xiàn)核酸檢測(cè)領(lǐng)域缺少這種能實(shí)現(xiàn)一體化、自助操作、高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)。在交流中一拍即合!他們立即決定開展研發(fā),希望新產(chǎn)品無需任何儀器設(shè)備或操作員培訓(xùn),即可作為門診、現(xiàn)場(chǎng)或家庭自助式病毒檢測(cè)手段。
說干就干!大年初四,三人在李寅青家里集合一起討論。習(xí)慣了平時(shí)討論把思路寫在展板上的仨人,把李寅青家的客廳當(dāng)成了實(shí)驗(yàn)室,用孩子的彩筆把思路寫在了墻上。
寫在墻上的研發(fā)思路
“之后,我們基本是按照當(dāng)時(shí)的思路一步步的實(shí)現(xiàn)?!?李寅青說,從2月的思路規(guī)劃、設(shè)計(jì)膠囊卡盒,到3月的Nest ITA和3D微流控,到4月的臨床樣本、卡盒集成,一步接一步。面對(duì)疫情,誰也不敢松懈,剛開始因?yàn)橐咔橛绊?,主要工作都是三個(gè)人親力親為,后來陸續(xù)有年輕的研究生們放棄寒假休息主動(dòng)加入,丁勝老師讓出了自己的細(xì)胞間,魯白老師派學(xué)生前來充實(shí)人手,程京老師給予很多指導(dǎo)意見,期間也獲得了很多熱心抗疫的企業(yè)幫助和奮斗在抗疫一線的醫(yī)務(wù)專家的指導(dǎo),現(xiàn)如今,他們已經(jīng)把5月、6月甚至到今年年底的攻關(guān)計(jì)劃安排好,逐步推進(jìn)。
正如白凈衛(wèi)、李寅青、劉鵬在采訪中所說:“疫情當(dāng)前,作為年輕的科研人員,真的沒有想太多,輕裝上陣,只想切切實(shí)實(shí)地為疫情防控能做點(diǎn)兒事!”
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