生命學院方顯楊課題組合作報道長鏈RNA位點特異性自旋標記新方法及其應用
近日， 清華大學生命學院方顯楊課題組與美國南加州大學化學系Peter Z. Qin教授課題組合作在《化學科學》（Chemical Science）雜志發(fā)表了題為“基于非天然堿基對系統(tǒng)的非變性條件下長鏈RNA轉(zhuǎn)錄后位點特異性自旋標記技術”（Posttranscriptional site-directed spin labeling of large RNAs with an unnatural base pair system under non-denaturing conditions）的文章。
電子順磁共振技術（Electron Paramagnetic Resonance, EPR）與核磁共振技術（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）類似，都是磁共振波譜學技術的分支。近年來，位點特異性自旋標記電子順磁共振技術（Site-Directed Spin Labeling Electron Paramagnetic Resonance, SDSL-EPR）已成為研究生物大分子（包括蛋白質(zhì), DNA, RNA等）的結(jié)構、動態(tài)特性與功能的重要技術。這項技術能夠在近生理條件下探測生物大分子不同功能狀態(tài)下的動態(tài)特性信息、提供自旋中心間20-100埃的距離信息、并且實時的檢測生物大分子的構象變化過程等。SDSL-EPR具有靈敏度高（相比于核磁共振）, 對生物大分子的分子量和均一性均沒有限制的優(yōu)點，SDSL-EPR已日益成為重要的整合結(jié)構生物學研究工具。
由于大多數(shù)生物大分子是天然逆磁性的，開展SDSL-EPR研究的前提是向生物大分子特定位點引入一個或成對的自旋標記，這些自旋標記可以是自由基或順磁金屬離子。當前，蛋白質(zhì)的位點特異性自旋標記技術已有很好的發(fā)展而相對成熟，而RNA，特別是長鏈RNA的位點特異性自旋標記仍十分具有挑戰(zhàn)性。例如，基于固相化學合成的標記方法主要局限于長度在100個核苷酸以下的短鏈RNA；基于DNA夾板指導的酶促連接法可實現(xiàn)長鏈RNA的位點特異性自旋標記，但其步驟往往十分繁瑣，還需要經(jīng)歷變性復性過程，該方法不僅效率低，其變性過程常常導致長鏈RNA的不可逆錯誤折疊。
針對現(xiàn)有RNA位點特異性自旋標記技術的局限性，清華大學生命學院方顯楊課題組利用包含NaM-TPT3非天然堿基對的系統(tǒng)，通過化學合成堿基帶有炔基修飾的TPT3（rTPT3CO）（圖1A），經(jīng)過PCR和體外轉(zhuǎn)錄反應，在RNA中位點特異性的引入TPT3CO，進一步利用點擊化學反應的高選擇性，通過與疊氮基修飾的氮氧自由基化合物反應，建立了在非變性條件下長鏈RNA位點特異性自旋標記的策略，并被成功應用于長度為419核苷酸的核糖核酸酶RNAse P的位點特異性自旋標記中（圖1B）。通過與美國南加州大學化學系Peter Z. Qin課題組合作，應用連續(xù)波（CW）EPR 技術證實了該方法的高標記效率、 研究了標記位點附近的動態(tài)特性、以及用雙電子自旋共振（DEER） EPR技術測定了成對自旋中心間的距離（圖1C）。該標記策略的成功建立將促進SDSL-EPR技術在長鏈RNA的結(jié)構與動態(tài)特性研究中的應用，并推動建立長鏈RNA的整合結(jié)構生物學研究方案。
圖1.基于非天然堿基對系統(tǒng)的長鏈RNA位點特異性自旋標記方案及其在電子順磁共振中的應用。
清華大學生命學院方顯楊研究員與美國南加州大學化學系Peter Z. Qin教授為該文的共同通訊作者。清華大學2016級PTN直博生王巖為該文的第一作者。南加州大學化學系博士后Venkatesan Kathiresan、博士生Wei Jiang參與了DEER EPR數(shù)據(jù)采集；清華大學生命學院2014級本科生陳垚宜（現(xiàn)在德國Freie Universität攻讀博士學位）、2017級CLS直博生胡艷萍參與了研究工作；北京大學藥學院化學生物系劉國全研究員、博士生白光燦在CW EPR數(shù)據(jù)收集方面提供了大力幫助。該項目受到國家自然科學基金委大科學裝置科學研究聯(lián)合基金重點支持項目、北京結(jié)構生物學高精尖創(chuàng)新中心、清華-北大生命科學聯(lián)合中心的經(jīng)費支持。
原文鏈接：https://doi.org/10.1039/D0SC01717E
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