生命學(xué)院陳春來和李丕龍課題組合作開發(fā)定量表征納米尺度下液-液相分離過程的新技術(shù)
2020年10月21日，清華大學(xué)生命科學(xué)院陳春來課題組和李丕龍課題組合作在《美國科學(xué)院院報》（PNAS）雜志發(fā)表了題為“利用雙色熒光互相關(guān)譜技術(shù)定量納米尺度下的液-液相分離過程”（Phase separation at the nanoscale quantified by dcFCCS）的文章。
相變作為物質(zhì)的一種特性（如水、冰和水蒸氣三相之間的轉(zhuǎn)換）在物理學(xué)界及日常生活中早已廣為人知。雖然相變是一個物理現(xiàn)象，但是近年的研究表明相變在生命活動中同樣發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在細(xì)胞中，相變是以生物大分子（蛋白質(zhì)和RNA）液-液相分離（Liquid-liquid phase separation，LLPS）的形式發(fā)生的，類似的現(xiàn)象在高分子化學(xué)和軟物質(zhì)物理等領(lǐng)域的研究已經(jīng)有近百年的歷史了。細(xì)胞中存在“液-液相分離”現(xiàn)象是在2009年被明確提出，并成為近幾年來生命科學(xué)領(lǐng)域的一個新興熱點(diǎn)。近期的研究表明，液-液相分離可能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)形成多種沒有脂膜包被的無膜細(xì)胞器。這些無膜細(xì)胞器通過對細(xì)胞組分的選擇性濃縮和分離，參與了包括RNA代謝，核糖體生成，DNA損傷應(yīng)答和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等許多過程。此外，液-液相分離過程與神經(jīng)退行性疾病、衰老等有著密切的關(guān)系。
目前主要是利用相差、寬場和共聚焦熒光顯微鏡來觀測液液相分離過程的發(fā)生、形貌和動態(tài)變化。為了突破常規(guī)成像技術(shù)中光學(xué)衍射極限（~200 nm）的限制，超分辨成像技術(shù)也被用于捕捉液滴相的形成、運(yùn)動和相變體中的納米微結(jié)構(gòu)。迄今為止，仍然缺乏合適的技術(shù)在納米尺度上定量捕捉液滴相的出現(xiàn)、增長速率、組成分子的化學(xué)計(jì)量比、與被招募分子的結(jié)合常數(shù)等重要的物理和化學(xué)參數(shù)。
為解決液-液相分離領(lǐng)域的以上技術(shù)空白，研究者發(fā)展了基于雙色熒光互相關(guān)譜（dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy，dcFCCS）的新型相分離表征手段，并利用此技術(shù)定量地表征基于Saccharomyces cerevisiae SmF（ySMF）蛋白的模型相變體系在1 nM到500 nM這一廣泛的濃度區(qū)間內(nèi)的寡聚體和液滴相的尺寸、增長速率、分子組成和與被招募分子的親和力。結(jié)果表明，液-液相分離可在光學(xué)衍射極限以下的納米尺度發(fā)生，且他們實(shí)驗(yàn)中所捕捉到的最小的液滴相半徑為20納米左右。此外，液滴相的形成及其大小并不影響被招募分子與液滴相的骨架分子之間的結(jié)合能力；這表明在熱力學(xué)平衡態(tài)下，納米和微米尺度的液滴相有著相同的選擇性濃縮和分離能力。在測量結(jié)果的基礎(chǔ)上，他們還構(gòu)建了蒙特卡洛模擬模型，用以描述溶液中單分散狀態(tài)的分子逐漸聚集形成納米尺度的液滴相的動態(tài)過程。結(jié)合模擬結(jié)果和對dcFCCS定量數(shù)據(jù)的二維聚類分析，他們標(biāo)定了在納米尺度發(fā)生液-液相分離過程的臨界濃度，比常規(guī)共聚焦顯微鏡的測量極限還要低近一個數(shù)量級。最后，研究者推測，由于納米尺度的液滴相的形成和消失速度比微米尺度的更快，因而納米尺度的相分離過程可能在快速調(diào)控和信號響應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要的生理功能。雙色熒光互相關(guān)譜（dcFCCS）將成為定量表征相分離過程和揭示其功能的重要技術(shù)手段。
清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳春來研究員和李丕龍研究員為本文共同通訊作者。清華大學(xué)生命學(xué)院15級博士生彭思佳、16級博士生李維平和17級博士生姚溢融為共同第一作者，PTN項(xiàng)目18級博士生邢文婧參與了研究。本工作獲得了國家自然科學(xué)基金委、北京結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心、北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心及清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心的經(jīng)費(fèi)支持。
原文鏈接
https://doi.org/10.1073/pnas.2008447117
FCS技術(shù)和ySMF相變體系相關(guān)文獻(xiàn)鏈接
https://doi.org/10.1073/pnas.2002971117
https://doi.org/10.1021/acs.jpcb.8b03476
https://doi.org/10.1074/jbc.RA120.012981
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