曾堅陽/李丕龍團(tuán)隊合作提出基于相分離的新冠聯(lián)合用藥新策略
曾堅陽/李丕龍團(tuán)隊合作提出基于相分離的新冠聯(lián)合用藥新策略
2021年04月06日 瀏覽次數(shù): 0
? ? ? ?近日，清華大學(xué)交叉信息研究院曾堅陽課題組與清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李丕龍課題組合作，系統(tǒng)性鑒定了SARS-CoV-2 N蛋白的相分離特性，深入探究了病毒RNA及復(fù)制相關(guān)蛋白參與N蛋白分相的情況，首次發(fā)現(xiàn)兩個靶向N蛋白的小分子藥物可以特異性干預(yù)N-viral RNA-nsp12復(fù)合物的相分離現(xiàn)象，進(jìn)而提高其他抗病毒藥物進(jìn)入靶點的效率，最終提出基于相分離的抗病毒藥物聯(lián)合使用新策略。相關(guān)成果《深入理解N蛋白相分離為新冠肺炎提供新的治理策略》（Understanding the phase separation characteristics of nucleocapsid protein provides a new therapeutic opportunity against SARS-CoV-2）于3月26日在《蛋白質(zhì)與細(xì)胞》（Protein & Cell）雜志上在線發(fā)表。
? ? ? ?嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）引發(fā)的新冠肺炎（coronavirus disease 2019, COVID-19）疫情仍在全球肆虐。據(jù)世界衛(wèi)生組織網(wǎng)站報道（https://covid19.who.int/），截至2021年3月下旬，新冠肺炎已造成全球223個國家和地區(qū)，1.26億余人感染，276萬余人死亡。面對這一突發(fā)的公共衛(wèi)生安全事件，深入挖掘SARS-CoV-2的作用機(jī)制，探尋有效的干預(yù)靶點和治療措施仍是當(dāng)務(wù)之急，具有重要的現(xiàn)實治療與防控意義。
? ? ? 在過去一年多時間里，人們對SARS-CoV-2的研究取得了很大進(jìn)展，包括臨床診斷、流行病學(xué)、病毒蛋白結(jié)構(gòu)、分子進(jìn)化機(jī)制、以及病毒與宿主互作等，但目前仍有大量問題亟待解決。作為冠狀病毒中含量最豐富和最保守的結(jié)構(gòu)蛋白，核衣殼（N）蛋白是一個重要的多功能蛋白質(zhì)，不僅負(fù)責(zé)識別病毒RNA并將其包裹成螺旋對稱的結(jié)構(gòu)，從而將病毒基因組與外部環(huán)境隔離，而且能與病毒或宿主細(xì)胞中多種蛋白質(zhì)相互作用，進(jìn)而操控宿主細(xì)胞的多個信號通路，促進(jìn)病毒RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。
? ? ? ?相分離（Phase separation）是生命科學(xué)領(lǐng)域近幾年發(fā)展起來的研究熱點。在一定條件下，溶液中的生物大分子會因相互作用而高度聚集濃縮，從普通溶液相中分離出來，形成獨立的、粘稠的液體相（相分離液滴）。短短數(shù)月間，已有國內(nèi)外的多個課題組報道了N蛋白能夠與病毒RNA發(fā)生相分離這一現(xiàn)象[1-3]。由于N蛋白對病毒基因組的包裝起著重要作用，作為一個關(guān)鍵的抗病毒靶點，N蛋白的相分離與之前廣泛開展的小分子藥物干預(yù)之間是否存在關(guān)聯(lián)呢？
? ? ? ?為解決這一疑問，?清華大學(xué)交叉信息研究院曾堅陽課題組與清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李丕龍課題組合作開展了相關(guān)研究[4]。研究人員首先通過IUPred2和PLAAC預(yù)測了N蛋白發(fā)生相分離的結(jié)構(gòu)特性，并通過體外重構(gòu)證實了其自身發(fā)生相分離的能力。進(jìn)一步的體外相變實驗表明，N蛋白與病毒特有序列UCUAA表現(xiàn)出較高的結(jié)合親和力，從而形成更為穩(wěn)定的相分離液滴，而完整的N蛋白結(jié)構(gòu)對于其相分離也是至關(guān)重要的。此外，研究人員還通過體外實驗證明了目前N蛋白上累積產(chǎn)生的部分高頻突變也會影響N蛋白的相分離特性。
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圖1. SARS-CoV-2 N蛋白相分離特性的鑒定
? ? ? ?已知SARS-CoV-2的復(fù)制是由Nsps蛋白為主的多亞基復(fù)制/轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（RTC）共同介導(dǎo)的，而該復(fù)合物的核心組分是RNA依賴型RNA聚合酶?（RdRp）的催化亞基（nsp12），也是極為重要的病毒靶點之一。值得注意的是，N蛋白是目前唯一已知能自由穿梭病毒“復(fù)制工廠”并促進(jìn)病毒RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的結(jié)構(gòu)蛋白。研究者發(fā)現(xiàn)單獨的nsp12蛋白在體外不能形成相分離，但它卻能被招募進(jìn)N蛋白驅(qū)動的相分離液滴中，且體外重構(gòu)的RdRp復(fù)合物（nsp12-nsp7-nsp8）也能被招募其中，這為N蛋白參與病毒轉(zhuǎn)錄、復(fù)制提供了依據(jù)。
? ? ? ? 此外，研究人員前期基于人工智能的藥物重定位框架篩選到了特異性靶向N蛋白的兩個小分子（CVL218和PJ34）[5]，體外實驗證明CVL218和PJ34的加入會影響N-viral RNA-nsp12復(fù)合物的液滴大小及其內(nèi)部流動性。研究人員猜測這一藥物處理后“疏松”的液滴狀態(tài)，可能會增加靶向nsp12蛋白的小分子（如瑞德西韋）對其靶點的可及性。隨后，研究人員與其合作團(tuán)隊在細(xì)胞層面進(jìn)行了活毒侵染實驗，結(jié)果表明CVL218和瑞德西韋聯(lián)合用藥組在抗病毒效果上的確優(yōu)于瑞德西韋單獨用藥組，一定程度上證明了上述假設(shè)。
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圖2. CVL218和PJ34干預(yù)N蛋白相分離的作用示意圖
? ? ? ?綜上所述，本研究系統(tǒng)性鑒定了SARS-CoV-2 N蛋白的相分離特性，首次發(fā)現(xiàn)靶向N蛋白的小分子CVL218和PJ34能夠干預(yù)N-viral RNA-nsp12復(fù)合物的液滴形態(tài)及內(nèi)部流動性，有效提高其他小分子藥物進(jìn)入病毒靶蛋白的效率，為后續(xù)新冠肺炎的治療提出了基于相分離機(jī)制的聯(lián)合用藥新策略。
? ? ? ?據(jù)悉，清華大學(xué)交叉信息研究院曾堅陽副教授與清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李丕龍研究員為本文的共同通訊作者；清華大學(xué)交叉信息研究院助理研究員趙誕、清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士后許偉凡、清華大學(xué)交叉信息研究院博士后張曉凡為本文的共同第一作者。本研究還得到了清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院李海濤教授、江蘇省疾病預(yù)防控制中心朱鳳才教授團(tuán)隊、甫康（上海）健康科技有限公司沈孝坤博士、清華大學(xué)蛋白制備與鑒定平臺、清華大學(xué)藥學(xué)技術(shù)中心活性篩選平臺的大力支持。此項研究工作獲得國家自然科學(xué)基金面上基金、青年基金，南京圖靈人工智能研究院和中關(guān)村海華前沿信息技術(shù)研究院支持。
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原文鏈接：
https://link.springer.com/article/10.1007/s13238-021-00832-z
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參考文獻(xiàn)：
1.???????? J. Wang, C. Shi, Q. Xu, H. Yin, SARS-CoV-2 nucleocapsid protein undergoes liquid-liquid phase separation into stress granules through its N-terminal intrinsically disordered region. Cell Discov 7, 5 (2021).
2.???????? A. Savastano, A. Ibanez de Opakua, M. Rankovic, M. Zweckstetter, Nucleocapsid protein of SARS-CoV-2 phase separates into RNA-rich polymerase-containing condensates. Nat Commun 11, 6041 (2020).
3.???????? C. Iserman et al., Genomic RNA Elements Drive Phase Separation of the SARS-CoV-2 Nucleocapsid. Mol Cell 80, 1078-1091 e1076 (2020).
4.???????? D. Zhao et al., Understanding the phase separation characteristics of nucleocapsid protein provides a new therapeutic opportunity against SARS-CoV-2. Protein Cell,? (2021).
5.???????? Y. Ge et al., A data-driven drug repositioning framework discovered a potential therapeutic agent targeting COVID-19. bioRxiv, (2020)
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