施一公研究組在《細胞》發(fā)文報道釀酒酵母剪接體 處于完成RNA剪接后構(gòu)象的高分辨率電鏡結(jié)構(gòu)
2017年11月17日，清華大學生命學院施一公教授研究組就剪接體的結(jié)構(gòu)與機理研究于《細胞》（Cell）雜志再次發(fā)表最新成果。這篇題為《釀酒酵母“催化后剪接體”的結(jié)構(gòu)》（Structure of the Post-catalytic Spliceosome from?Saccharomyces cerevisiae）的論文報道了釀酒酵母剪接體呈現(xiàn)RNA剪接反應完成后狀態(tài)（定義為“P復合物”）、整體分辨率為3.6埃的三維結(jié)構(gòu)，首次展示了pre-mRNA中3’剪接位點的識別狀態(tài)，該結(jié)構(gòu)為回答RNA剪接反應過程中pre-mRNA中的3’剪接位點如何被識別，第二步轉(zhuǎn)酯反應如何發(fā)生以及成熟的mRNA如何被釋放等關(guān)鍵問題提供了重要的結(jié)構(gòu)信息。
1977年，科學家們首次發(fā)現(xiàn)來自于腺病毒的mRNA與其對應的DNA轉(zhuǎn)錄模板并不能形成連續(xù)的雜交雙鏈，而是在雜交雙鏈的不同位置伸出了環(huán)狀的DNA單鏈。這個重大發(fā)現(xiàn)表明，遺傳信息從DNA傳遞到mRNA上并不只是通過轉(zhuǎn)錄，還需要pre-mRNA剪接來進一步完成“無效”遺傳信息的去除與有效遺傳信息的拼接?！盁o效”的遺傳信息不具有翻譯功能，被稱為內(nèi)含子，而可以被核糖體翻譯的有效遺傳信息叫做外顯子，內(nèi)含子被去除、外顯子被連接這一過程即為RNA剪接。RNA剪接普遍存在于真核生物中，隨著物種的進化，含有內(nèi)含子的基因數(shù)量增加，發(fā)生RNA剪接的頻率也相應增高，使得一個基因編碼多個蛋白質(zhì)成為可能，極大的豐富了蛋白質(zhì)組的多樣性，也是真核生物多樣性的重要原因之一。
RNA 剪接是真核生物基因表達調(diào)控的重要環(huán)節(jié)之一，負責執(zhí)行這一過程的是細胞核內(nèi)一個巨大且高度動態(tài)變化的分子機器——剪接體（spliceosome）。從1977年首次發(fā)現(xiàn)RNA剪接至本世紀初，科學家們通過免疫沉淀、基因敲除、交聯(lián)質(zhì)譜、建立體外剪接反應系統(tǒng)等研究手段，初步建立起剪接體的組裝與解聚的發(fā)生過程，以及蛋白與蛋白、蛋白與核酸之間的相互作用、相互調(diào)控等復雜的RNA剪接調(diào)控網(wǎng)絡。RNA剪接的本質(zhì)是兩步轉(zhuǎn)酯反應，在剪接反應過程中，多種蛋白質(zhì)-核酸復合物及剪接因子按照高度精確的順序發(fā)生結(jié)合和解聚，依次形成預組裝復合物U4/U6.U5 Tri-snRNP（U4/U6.U5三小核核糖核蛋白復合物）以及至少7個狀態(tài)的剪接體B、Bact、B*、C、C*、P以及ILS復合物（圖1）。
圖1 ?RNA剪接示意圖
（圖片來源: Shi Y. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2017.）
但是由于剪接體組成蛋白、核酸種類多，分子量大，并具有多種動態(tài)結(jié)構(gòu)，該領域進展一直比較緩慢，獲得剪接體的高分辨率三維結(jié)構(gòu)更是世界公認的難題。2015年，施一公研究組率先突破，在世界上首次報道了裂殖酵母剪接體3.6埃的高分辨率結(jié)構(gòu)，首次展示了剪接體催化中心近原子分辨率的結(jié)構(gòu)。這一重大研究成果對RNA剪接機理的研究產(chǎn)生革命性影響。自2015年第一個剪接體結(jié)構(gòu)發(fā)表以后，施一公研究組相繼解析了5個不同狀態(tài)剪接體復合物的高分辨率結(jié)構(gòu)，分別是釀酒酵母3.8埃的預組裝復合物U4/U6.U5 Tri-snRNP、3.5埃的激活狀態(tài)復合物Bact?complex、3.4埃的第一步催化反應后復合物C complex、4.0埃的第二步催化激活狀態(tài)下的C* complex，以及3.5埃的內(nèi)含子套索剪接體ILS complex的結(jié)構(gòu)。這些已解析的剪接體基本覆蓋了整個RNA剪接循環(huán)，從分子層面解釋了剪接體如何組裝，如何被激活，第一步轉(zhuǎn)酯反應如何發(fā)生以及完成RNA剪接反應后的剪接體如何解聚等工作機理。但是第二步轉(zhuǎn)酯反應如何被調(diào)控并發(fā)生，則需要捕獲一個最為關(guān)鍵的剪接體狀態(tài)——催化后剪接體，即P complex。
不同于上述已解析的多個狀態(tài)的剪接體，P complex具有更高度的動態(tài)性與瞬時性，在正常生理狀態(tài)下極難捕獲。在最新發(fā)表的這篇《細胞》論文中，施一公研究組進一步探索并優(yōu)化了蛋白提純方案，通過在釀酒酵母中表達關(guān)鍵蛋白的失活突變體導致剪接體無法釋放成熟的mRNA，從而獲得了穩(wěn)定的、性質(zhì)良好的P complex樣品。隨后利用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)重構(gòu)出了總體分辨率為3.6埃的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，并搭建了原子模型（圖2）。這一結(jié)構(gòu)首次展示了RNA剪接兩步轉(zhuǎn)酯反應完成后剪接體的整體結(jié)構(gòu)以及內(nèi)部蛋白質(zhì)、核酸組分的組裝情況，其中可以清晰的看到原本被內(nèi)含子隔開的兩個外顯子已經(jīng)共價連接形成成熟的mRNA并且被U5 snRNA識別固定在剪接體的反應中心。值得一提的是，在這個結(jié)構(gòu)中，第一次觀察到了pre-mRNA中3’剪接位點AG被分支點A和5’剪接位點的第一個核苷酸G通過非經(jīng)典的堿基互補配對共同識別的機制，這兩個核苷酸AG還進一步被5’剪接位點的G和U6 snRNA通過堿基堆積力固定。因此，該結(jié)構(gòu)的解析，首次展示了3’剪接位點被識別、關(guān)鍵蛋白Prp22參與成熟的mRNA釋放等重要的結(jié)構(gòu)信息，為領域內(nèi)對第二步轉(zhuǎn)酯反應發(fā)生時3’剪接位點如何被識別的長達數(shù)年的猜想與爭論提供了最有效的結(jié)構(gòu)證據(jù)。
圖2 釀酒酵母催化后剪接體的三維結(jié)構(gòu)
清華大學施一公研究組一直致力于捕捉RNA剪接過程中處于不同動態(tài)變化的剪接體結(jié)構(gòu)，從而從分子層面闡釋RNA剪接的工作機理。截至目前為止，施一公研究組在酵母中一共解析了7個不同狀態(tài)的剪接體高分辨的三維結(jié)構(gòu)（如圖3），從預組裝到被激活，從發(fā)生兩步轉(zhuǎn)酯反應到剪接體的解聚，這7個狀態(tài)的剪接體基本覆蓋了整個剪接通路，首次將剪接體介導RNA剪接的過程串聯(lián)起來，為理解RNA剪接的分子機理提供了最清晰、最全面的結(jié)構(gòu)信息。由于對RNA剪接領域做出的重要貢獻，施一公教授于不久前獲得了未來科學大獎生命醫(yī)學獎。
圖3 施一公研究組解析的酵母剪接體結(jié)構(gòu)匯總
（圖片來源: Shi Lab）
清華大學生命學院施一公教授為本文的通訊作者；清華大學生命學院三年級博士研究生白蕊、生命學院博士后閆創(chuàng)業(yè)以及醫(yī)學院五年級博士研究生萬蕊雪為該文的共同第一作者；清華大學冷凍電鏡平臺的雷建林博士為冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集提供了幫助。電鏡數(shù)據(jù)采集于清華大學冷凍電鏡平臺，計算工作得到清華大學高性能計算平臺、國家蛋白質(zhì)設施實驗技術(shù)中心(北京)的支持。本工作獲得了北京結(jié)構(gòu)生物學高精尖創(chuàng)新中心及國家自然科學基金委的經(jīng)費支持。
?
原文鏈接：
http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)31264-3
相關(guān)論文鏈接：
http://science.sciencemag.org/content/early/2016/01/06/science.aad6466
http://science.sciencemag.org/content/early/2015/08/19/science.aac8159
http://science.sciencemag.org/content/early/2015/08/19/science.aac7629
http://science.sciencemag.org/content/early/2016/07/20/science.aag0291
http://science.sciencemag.org/content/early/2016/07/20/science.aag2235
http://science.sciencemag.org/content/early/2016/12/14/science.aak9979.full
http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)30954-6
?
版權(quán)與免責聲明：本網(wǎng)頁的內(nèi)容由收集互聯(lián)網(wǎng)上公開發(fā)布的信息整理獲得。目的在于傳遞信息及分享，并不意味著贊同其觀點或證實其真實性，也不構(gòu)成其他建議。僅提供交流平臺，不為其版權(quán)負責。如涉及侵權(quán)，請聯(lián)系我們及時修改或刪除。郵箱：sales@allpeptide.com