清華閆創(chuàng)業(yè)課題組合作揭示單羧酸轉運復合物MCT1/Basigin-2的質子偶聯(lián)轉運機制和候選抗癌藥物的抑制機理
近日，清華大學生命科學學院研究員閆創(chuàng)業(yè)與澳大利亞新南威爾士的學者合作發(fā)布了關于抗癌藥物靶點MCT1蛋白復合物的轉運與小分子抑制機理的重要成果。該工作通過結構生物學和生物化學相結合的手段闡明MCT1的轉運機理和小分子抗癌候選藥物抑制機制，為進一步靶向MCTs的藥物發(fā)現(xiàn)奠定了基礎。
以乳酸、丙酮酸和酮體為代表的單羧酸是大多數(shù)哺乳動物細胞中的必需代謝產(chǎn)物，這些單羧酸代謝物的動態(tài)吸收和再分配主要由質子偶聯(lián)的單羧酸轉運蛋白完成（MCTs）。在已鑒定的MCTs中，MCT1是最早被發(fā)現(xiàn)且廣泛分布在各組織細胞中、維持細胞基本穩(wěn)態(tài)的重要亞型。在生理條件下，MCT1-4協(xié)同糖酵解型細胞和氧化型細胞之間的乳酸穿梭，這是不同組織中乳酸穩(wěn)態(tài)的關鍵過程，對于肌細胞和神經(jīng)細胞的能量代謝具有重要作用。MCTs的表達改變也與神經(jīng)退行性疾病、癲癇、腦缺血等多種腦疾病密切相關。更重要的是，MCT1、2和4在多種癌癥中的高表達與癌癥的發(fā)展有密切關系。由MCT1和其他亞型共同介導的乳酸穿梭能夠連接以糖酵解為主要產(chǎn)能方式（Glycolytic tumor cell）和以線粒體氧化為主要產(chǎn)能方式（Oxidative tumor cell）的癌細胞使其形成協(xié)同代謝，從而促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展（圖1）。
圖1 MCT1-4介導的糖酵解型和氧化型腫瘤細胞之間的乳酸穿梭
由于其在癌癥發(fā)生中的重要作用，MCT1被認為是重要的癌癥治療靶點。多個早期研究已指出抑制MCT1活性能夠有效減緩癌細胞的生長和增殖，同時多個以MCT1為靶點的小分子抑制劑也被報道。然而，由于缺乏結構信息，MCT1的轉運機理和小分子抑制劑的抑制機制一直未被闡明。
針對上述問題，清華大學生命科學學院研究員閆創(chuàng)業(yè)和澳大利亞新南威爾士大學研究員蔣鑫合作報道了MCT1和其伴侶蛋白Basigin-2在結合天然底物乳酸和不同小分子抑制劑的結構。通過對比野生型外向開口構象（Outward-facing conformation）的MCT1結構和模擬持續(xù)質子化的D309N突變體的內(nèi)向開口構象（Inward-facing conformation）結構，研究人員闡明了MCT1的底物識別、質子偶聯(lián)轉運和交替開放機理。更進一步，文章通過解析MCT1/Basigin-2蛋白復合體與三個代表性小分子抑制劑AZD3965、BAY-8002和7ACC2的結構闡明了不同構象下小分子抑制劑與MCT1蛋白的結合模式（圖2A）。
圖2 MCT1/Basigin-2復合物與天然底物及三種經(jīng)典小分子抑制劑在不同構象下的結構
作為一期臨床實驗中的先導化合物，AZD3965代表了最有希望成為抗癌藥物的MCT1抑制劑。然而，由于AZD3965對于MCT1的選擇性抑制，其對于MCT1和MCT4高表達的癌細胞殺傷效果欠佳。為了給進一步藥物優(yōu)化提供信息，研究人員根據(jù)MCT1/Basigin-2與AZD3965結合的復合物結構信息設計了一系列突變體，通過生化功能實驗闡明了AZD3965對MCT亞型的選擇性機理。由此，該工作通過結構生物學和生物化學相結合的手段闡明MCT1的質子偶聯(lián)轉運機制和小分子候選藥物的抑制機理，為進一步靶向MCTs的藥物發(fā)現(xiàn)奠定了基礎。
值得一提的是，MCT1/Basigin-2復合物沒有對稱性且分子量只有大約80kDa，并且胞外區(qū)域比較柔性，只有50kDa的穿膜區(qū)比較穩(wěn)定（圖2B），這對冷凍電鏡的結構解析形成了巨大挑戰(zhàn)。為了解決這些技術難題，研究人員設計了一種“降噪-再加權”(noise reduction and re-weighting methods)的新型數(shù)據(jù)處理方法，結合之前開發(fā)的“引導性多參照三維分類”(guided multi-reference 3D classification)方法，以及新發(fā)展的優(yōu)選顆粒輔助三維分類策略（Seed-facilitated 3D classification）有效的消除了蛋白外的噪音信號，進一步突破了冷凍電鏡解析非對稱性膜蛋白樣品的分子量下限，分辨率達到3?（圖2C、D）。這一方法將為進一步研究小分子量非對稱性膜蛋白提供了新的思路。
該項研究成果于2020年12月16日在線發(fā)表在生命科學領域頂尖雜志《細胞》（Cell）上，題為“候選抗癌藥物對人源單羧酸轉運蛋白抑制機理的結構生物學研究”（Structural basis of human monocarboxylate transporter 1 inhibition by anti-cancer drug candidates）。
清華大學生命科學學院研究員閆創(chuàng)業(yè)和澳大利亞新南威爾士大學研究員蔣鑫為共同通訊作者；清華大學生命科學學院2016級博士生王楠和新南威爾士大學研究員蔣鑫為本文的共同第一作者；清華大學生命學院2017級博士生張碩和2019級博士生朱盎岐參與了數(shù)據(jù)收集和生化實驗；清華大學生命學院博士后袁亞飛、技術員徐翰文對本研究提供了幫助；清華大學冷凍電鏡平臺主管雷建林博士為冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集提供了幫助。
實驗的電鏡數(shù)據(jù)采集受到清華大學冷凍電鏡平臺和西湖大學冷凍電鏡平臺的支持，實驗的計算工作得到清華大學高性能計算平臺、國家蛋白質設施實驗技術中心（北京）的支持。本研究獲得了國家自然科學基金重點研發(fā)計劃、北京市科技新星計劃、北京高校卓越青年科學家計劃項目、清華大學結構生物學高精尖創(chuàng)新中心與清華-北大生命科學聯(lián)合中心的經(jīng)費支持。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.11.043
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