生命學院陳國強團隊利用溫控動態(tài)調控開關在大腸桿菌實現(xiàn)聚羥基脂肪酸酯的精確組裝
合成生物學通過構建各類動態(tài)調控系統(tǒng)控制精確調控代謝通路，實現(xiàn)目標產物的生產和特定的細胞行為。然而在代謝工程領域，由于實驗室構建的基因線路往往缺少魯棒性，要想在大體積的發(fā)酵體系中實現(xiàn)生長對數(shù)期的中后期的動態(tài)調控依然有很大的挑戰(zhàn)。簡單的化學誘導開關由于誘導物的高成本、不可移除性已經不能滿足生物生產的需求；光誘導系統(tǒng)在高細菌密度時難以穿透發(fā)酵罐進行精確調控；實驗室構建的復雜的、多元件的開關在大尺度的發(fā)酵體系往往會失效。與其他感應系統(tǒng)相比，溫度開關有低成本、快速響應、可移除等優(yōu)勢。工業(yè)生產已經有成熟的熱質傳遞理論，因此在發(fā)酵罐體系能夠比較容易進行溫度調控。總體而言，溫控開關有應用于大規(guī)模發(fā)酵的潛力。
生命學院陳國強團隊于2021年3月3日在Nature Communications雜志上發(fā)表題為“在大腸桿菌中利用可逆溫度調控開關實現(xiàn)雙向動態(tài)調控”（Reversible thermal regulation for bifunctional dynamic control of gene expression in Escherichia coli）的文章https://www.nature.com/articles/s41467-021-21654-x ，論文利用由溫度控制的雙向動態(tài)調控開關，在7-L發(fā)酵罐中實現(xiàn)了生長對數(shù)期中后期的調控，實現(xiàn)了聚羥基脂肪酸酯（PHA）的精確組裝，證明了溫控開關用于大規(guī)模生產的潛力。在不同尺度實現(xiàn)組織調控：納米級的生物高分子聚合物合成，微米級的單細菌形態(tài)控制，毫米級的細菌菌落“類樹木年輪”菌落，證明了構建的溫控開關具有普遍適用性和系統(tǒng)穩(wěn)定性（圖1）。
圖1. 利用溫控開關T-switch實現(xiàn)生物圖案、細菌變形及高分子組裝
論文首先基于溫度敏感的轉錄因子CI857和TetR家族的轉錄抑制子PhlF構建出溫度敏感的基因開關T-switch。在30℃和37℃時，編碼綠色熒光蛋白的基因sfgfp和編碼紅色熒光蛋白的基因mrfp分別轉錄表達，經過一系列優(yōu)化和表征，雙向動態(tài)溫度調控開關T-switch可以在溫度在30℃和37℃之間實現(xiàn)不同基因的同時轉錄上調和下調。
隨后T-switch被應用于三個不同的場景。第一個場景是受溫度的季節(jié)性變化觸發(fā)的樹木年輪的啟發(fā)，通過模仿“年輪”圖案的形成過程，在平板上生成類年輪的細菌菌環(huán)，創(chuàng)造出新的不依賴于濃度信號差生成的圖案（pattern），實現(xiàn)了毫米級的圖案控制（圖2）。通過對生物圖案形成的探究與創(chuàng)造，可以為研究者審視生物發(fā)育、生長、形成圖案提供新的思路。
圖2. 類樹木年輪的細菌菌落形成
第二個場景是細菌形態(tài)的變化，論文使用T-switch控制mreB和ftsZ基因，通過改變溫度實現(xiàn)細菌從球形、桿狀到纖維狀動態(tài)變化，實現(xiàn)了單細胞微米級的形態(tài)控制（圖3）。細菌產物有一大類是在胞內以“內涵體”形式存在的產物，包括PHA、糖原、聚氨基酸等。細胞體積大小決定了這些產物生產的上限，而細菌往往只有0.5-2μm大小，因此通過改變細菌的形狀能夠有效地改變“內涵體”產物的積累，越大越長的細菌能夠使得胞內產物積累更多。另外通過對細菌形態(tài)的調節(jié)，使得細菌體積增大、細菌長度變長，提高了細菌與發(fā)酵液自動分離的能力，使得下游收集菌體過程更方便，能耗成本更低。
圖3. 溫度控制細菌形態(tài)的變化
第三個場景是細胞內高分子的精確組裝。聚羥基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates, PHAs）是一類主要由微生物合成，生物可降解且具有生物相容性的高分子材料，將有很大的潛力解決全球塑料污染問題。目前已經商業(yè)化的PHA例如PHBV，P3HB4HB以及PHBHHx，都是隨機共聚物。而嵌段聚合物在隨機聚合物的基礎上不僅可以改善材料性能，還可以解決材料老化等問題【4】，但是由于PHA生產的相關碳源（前體）價格昂貴，不用葡萄糖等非相關碳源進行生產，是很難實現(xiàn)嵌段PHA的工業(yè)化，因此，通過使用具有成本效益的碳源來設計無誘導劑的PHA嵌段共聚物生產開關非常有必要。論文通過T-switch在大腸桿菌中控制3-羥基丁酸（3HB）和4-羥基丁酸（4HB）出現(xiàn)的時序，成功在7L發(fā)酵罐生成了4HB比例從30到89mol%的隨機共聚物P（HB-co-4HB）和4HB比例從10到60mol%的嵌段共聚物P3HB-b-P4HB，隨著4HB單體比例的變化，隨機共聚物P（HB-co-4HB）的熔融溫度從無到有、玻璃化轉變溫度降低、楊氏模量和拉伸應力增強、斷裂延伸率保持在800%以上。和隨機共聚物相比，相同4HB比例的嵌段共聚物P3HB-b-P4HB有PHB和P4HB的特征熔融溫度峰、楊氏模量和拉伸應力顯著高于隨機共聚物，體現(xiàn)了更加優(yōu)良的材料性能。上述實驗在大尺寸的發(fā)酵罐復雜體系統(tǒng)完成了納米級的聚合物的精確合成控制，證明了該系統(tǒng)的穩(wěn)定性。
綜上所述，本研究構建出一個溫度控制可多次調控的雙向動態(tài)調控開關，實現(xiàn)了菌落圖案、細菌形態(tài)控制和PHA精確組裝，并且能夠在7-L發(fā)酵罐中細菌高密度發(fā)酵時實現(xiàn)動態(tài)調控。
清華大學生命學院、清華-北大生命科學聯(lián)合中學博士生王宣及清華大學學堂班本科生韓佳寧（現(xiàn)康奈爾大學博士生）為論文的共同第一作者，清華大學生命學院陳國強教授及中科院深圳先進技術研究院合成生物學研究所葉健文為論文的共同通訊作者，生命學院博士生張旭、馬悅原、林藝娜、王歡，北京大學物理學院碩士生李典杰，生命學院本科生鄭陶然以及生命學院吳赴清副研究員參與該研究。該研究得到了科技部重大專項、國家自然科學基金委、清華-INDITEX持續(xù)發(fā)展基金的資助。
Wang, X., Han, JN., Zhang, X. et al. Reversible thermal regulation for bifunctional dynamic control of gene expression in Escherichia coli. Nat Commun 12, 1411 (2021). ?https://www.nature.com/articles/s41467-021-21654-x
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