魯鳳民團(tuán)隊采用基因編輯和RNA干擾技術(shù)高效抑制HBV復(fù)制獲新進(jìn)展
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近期，北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院魯鳳民教授課題組與許中偉、夏寧邵教授等合作，在《Theranostics》雜志上在線發(fā)表了題為“The gRNA-miRNA-gRNA ternary cassette combining CRISPR/Cas9 with RNAi approach strongly inhibits hepatitis B virus replication”的研究論文。該研究通過模擬microRNA（miRNA）的生成過程，整合雙gRNA導(dǎo)向的CRISPR/Cas9和RNA干擾技術(shù)，高效破壞乙型肝炎病毒（HBV）的復(fù)制模板-共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），探索病毒清除新路徑。北醫(yī)王杰講師、陳然和張瑞陽博士研究生為該論文的共同第一作者。
目前，我國仍有慢性HBV感染者約7800萬人，慢乙肝患者約2800萬人。HBV感染仍是我國病毒性肝炎、肝硬化及肝癌的重要致病因素。作為HBV復(fù)制模板的cccDNA，由于其半衰期相對較長，加上cccDNA池的不斷補充，使得細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA持續(xù)存在、感染慢性化。目前，臨床上治療慢乙肝的常用藥物為核苷（酸）類似物和長效干擾素，二者均不直接作用于cccDNA，難以有效清除病毒實現(xiàn)臨床治愈。因此，研發(fā)直接靶向cccDNA的藥物，尋找清除cccDNA的新方法和新策略，是當(dāng)前慢乙肝治療藥物研發(fā)的熱點。
該研究以miRNA-31為基本骨架，通過模擬其核心序列的二級結(jié)構(gòu)設(shè)計HBV特異的miRNA（miR-HBV），miRNA兩側(cè)側(cè)翼序列為特異性靶向cccDNA不同位點的引導(dǎo)RNA（gRNA）。如圖所示，該gRNA-(miR-HBV)-gRNA三聯(lián)體表達(dá)體系導(dǎo)入細(xì)胞后，在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成gRNA-(miR-HBV)-gRNA長轉(zhuǎn)錄本，經(jīng)內(nèi)源的Drosha/DGCR8復(fù)合體剪切，形成2個gRNA和1個miR-HBV前體（pre-miR-HBV）。進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，pre-miR-HBV 進(jìn)一步經(jīng)Dicer酶剪切，形成成熟的miR-HBV。一方面雙gRNA導(dǎo)向的CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過切割并去除cccDNA的關(guān)鍵調(diào)控和編碼序列直接破壞cccDNA，另一方面通過miR-HBV在轉(zhuǎn)錄后水平抑制HBV復(fù)制，進(jìn)而抑制cccDNA池的補充，協(xié)同促進(jìn)HBV cccDNA的清除。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pri-miRNA-31的側(cè)翼序列長度為38 bp時與雙gRNA組成的三聯(lián)體對HBV復(fù)制的抑制效率最高。
雙gRNA導(dǎo)向的CRISPR/Cas9整合RNAi技術(shù)高效抑制HBV復(fù)制模式圖
當(dāng)然，該技術(shù)離臨床應(yīng)用尚有較遠(yuǎn)的距離。一方面如何高效和靶向性地將三聯(lián)體遞送到HBV感染的肝細(xì)胞內(nèi)是需要攻克的一大障礙；另一方面，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的脫靶效應(yīng)也有安全性之虞。然而，近年來隨著Cas核酸酶的不斷改造，其脫靶效應(yīng)得到了有效控制，安全性大為提高。而且，隨著金黃色葡萄球菌Cas9的發(fā)現(xiàn)，使得CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以裝入腺相關(guān)病毒載體中，致使該技術(shù)應(yīng)用于臨床的距離逐漸縮短。
總之，本研究通過gRNA-(miR-HBV)-gRNA三聯(lián)表達(dá)框架聯(lián)合CRISPR/Cas9和RNA干擾技術(shù)高效破壞cccDNA，促進(jìn)HBV清除，為慢乙肝抗病毒治療提供了新的思路。該項研究得到國家十二五重大科技專項計劃“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”項目和國家自然科學(xué)基金的支持。
論文鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28839466
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