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作為一種生活中的常見致癌物，甲醛會對人體產(chǎn)生很大的危害。但另一方面，生物體本身也產(chǎn)生一定量的甲醛。這些“內源”甲醛分子是多條生理代謝途徑的原料或產(chǎn)物，與細胞的存活與生長密切相關。有研究顯示，作為一碳化合物，甲醛能夠被納入一碳循環(huán)（one-carbon-cycle），用于DNA與必需氨基酸的合成（Burgos-Barragan, G. et al. Nature, 2017, 548, 549–554）。雖然甲醛的這些生理功能逐漸被揭示，與甲醛相關的許多疑問仍有待探索。例如，細胞是通過何種機制來特異識別和感知內源甲醛的濃度？甲醛對應的信號是如何在細胞內傳遞，產(chǎn)生響應，并避免甲醛造成的損傷？我們又能否對細胞內的甲醛動態(tài)分布進行精準探測，以揭示甲醛的生理功能呢？

針對上述問題，北京大學化學與分子工程學院、北大-清華生命科學聯(lián)合中心陳鵬課題組著手對一個獨特的甲醛響應的轉錄因子HxlR進行了深入研究，首次從結構與化學機理上揭示了甲醛誘導HxlR蛋白發(fā)生分子內交聯(lián)反應，所產(chǎn)生的“亞甲基橋”（methylene bridge）這一特殊化學修飾使HxlR產(chǎn)生功能獲得性（gain-of-function）生理響應。基于這一發(fā)現(xiàn)，他們開發(fā)了首個可遺傳編碼的甲醛熒光探針（FAsor），成功應用于檢測活細胞以及小鼠腦組織切片中甲醛的動態(tài)變化。相關成果于2021年1月25日在線發(fā)表在《自然-通訊》雜志（Nature Communications），“Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction” （DOI：10.1038/s41467-020-20754-4）。

甲醛對于生物學和化學領域的研究者來說并不陌生。如果思考這樣一個問題，甲醛與蛋白質會發(fā)生什么化學反應？答案可能是，甲醛能夠與蛋白質上的親核性氨基酸側鏈發(fā)生加成反應；甲醛作為蛋白質交聯(lián)試劑，能夠在蛋白質的親核性殘基（如賴氨酸）之間形成交聯(lián)，使蛋白質變性失活。然而，甲醛使蛋白質變性的原因不能與細胞響應甲醛的機制劃等號。首先，使蛋白質變性的甲醛濃度遠高于細胞內源甲醛的濃度范圍；其次，甲醛使蛋白質變性是一種非特異性的、損傷性的過程，這很難作為細胞精確響應和調控生理水平甲醛的工作機制。因此，甲醛在細胞中有哪些特異性的響應模式，這些響應是通過什么樣的分子機制實現(xiàn)的，仍是一個未知的問題。在枯草芽孢桿菌發(fā)現(xiàn)的HxlR蛋白是一種轉錄激活因子，能夠在甲醛刺激下激活下游基因轉錄，進行功能獲得性（gain-of-function）的生理響應（Yurimoto, H. et al. Mol. Microbiol., 2005, 57, 511–519）。受HxlR這一特性的吸引，研究團隊選擇HxlR蛋白以探究其“特異”響應甲醛分子的機制。

首先，為了確認HxlR蛋白直接與甲醛發(fā)生了化學反應，研究團隊結合質譜分析與X射線晶體學研究了HxlR與甲醛的相互作用。HxlR與甲醛共孵育后的質譜分析顯示，甲醛能夠使HxlR發(fā)生+12 Da的分子量偏移。這一變化與甲醛誘導的亞甲基橋連一致，說明HxlR很有可能直接與甲醛發(fā)生了反應。進一步的二級質譜肽段鑒定，以及HxlR-甲醛共晶結構解析共同佐證了這一點。兩者的結果均顯示，與甲醛反應之后，位于HxlR蛋白N端第一個α螺旋的半胱氨酸（Cys11）與賴氨酸（Lys13）殘基之間形成了位點特異的“亞甲基橋”。針對這一發(fā)現(xiàn)，研究團隊又通過位點突變來確認該交聯(lián)反應與HxlR蛋白功能的聯(lián)系。結果顯示，無論突變哪一個位點（C11A或K13A），HxlR都將失去響應甲醛的能力。這說明HxlR蛋白的確通過Cys11和Lys13特異性識別甲醛，形成亞甲基橋這一獨特的化學修飾，實現(xiàn)轉錄功能的激活。

甲醛與HxlR蛋白位點特異性反應形成分子內“亞甲基橋”

那么甲醛誘導的分子內交聯(lián)又是如何實現(xiàn)對HxlR蛋白功能的激活？研究團隊接下來仔細分析了不同處理條件與突變體的HxlR蛋白晶體結構。通過對甲醛處理前后的HxlR結構對比，他們發(fā)現(xiàn)看似簡單的亞甲基橋卻引起了蛋白整體構象的極大變化！甲醛誘導的Cys11-Lys13亞甲基橋迫使原本位于同一α螺旋兩側的兩個氨基酸側鏈相互靠近，扭曲了α螺旋結構，并“牽一發(fā)而動全身”，帶動HxlR蛋白N端主鏈朝向翻轉（N-terminal flipping），使得蛋白整體構象發(fā)生改變，極大地增強HxlR蛋白與DNA的結合能力，激活下游基因的轉錄。至此，研究團隊揭示了HxlR特異性響應甲醛并發(fā)生結構與功能轉換的分子機制。

甲醛通過位點特異的亞甲基橋連激活轉錄因子HxlR

這一甲醛響應機制的解析進一步為研究團隊提供了啟示：HxlR特異性響應甲醛的構象變化可以用于設計甲醛檢測的熒光探針。目前已報道的甲醛探針均為小分子探針，時空分辨率與細胞、組織特異性受到限制，難以對甲醛的細胞內分布進行精確檢測。基因編碼的熒光探針，在時空分辨的檢測、動態(tài)檢測等方面都更有優(yōu)勢，但鑒于甲醛響應機制研究的缺乏，難以設計基于蛋白質的探針。而HxlR蛋白相應甲醛的分子機制的解析無疑為這一問題提供了解決方案。

基于對HxlR蛋白的結構分析，研究團隊向HxlR特定位點嵌入了對結構變化敏感的熒光蛋白，并通過篩選和優(yōu)化，成功開發(fā)出一系列新型基因編碼的甲醛熒光探針。他們首先在體外實驗中對探針進行了表征。之后，研究團隊利用該探針，成功進行了細胞內甲醛濃度的動態(tài)檢測；通過多色熒光成像，對不同亞細胞空間下甲醛變化進行了同步檢測；通過干擾甲醛代謝通路，記錄了探針對胞內甲醛生理濃度變化的響應。進一步，研究團隊與北京大學李毓龍課題組合作，檢測了該探針在小鼠腦組織切片中對甲醛的動態(tài)響應，驗證了該探針具有動物組織水平的應用潛力。

基于甲醛響應轉錄因子HxlR蛋白的新型甲醛探針

?綜上，該工作實現(xiàn)了對“甲醛響應”蛋白HxlR的機制解析，發(fā)現(xiàn)了甲醛誘導HxlR產(chǎn)生獨特化學修飾，并由該亞甲基橋引起構象變化和激活轉錄調控的分子機制。受此啟發(fā)，研究團隊進一步開發(fā)了首個遺傳編碼的甲醛探針，為研究細胞內源甲醛的調控與功能提供了重要工具。

需要指出的是，本研究發(fā)現(xiàn)的“分子內交聯(lián)”這一獨特的化學修飾，可能與蛋白酰基化、烷基化等翻譯后修飾類似，能夠調控蛋白質的活性與功能。例如近期有研究顯示，糖酵解通路的中間產(chǎn)物丙酮醛，可以對細胞氧化應激通路蛋白KEAP1進行“分子內交聯(lián)”修飾，在鄰近的精氨酸（Arg）與半胱氨酸（Cys）之間產(chǎn)生交聯(lián)，啟動下游應激響應（Bollong, M. et al. Nature, 2018, 562, 600–604）。可以預見,“分子內交聯(lián)”修飾的種類、性質與功能，值得進一步探索。

?陳鵬課題組2012級博士畢業(yè)生祝融峰、張功為共同第一作者；北京大學生命科學學院、生命科學聯(lián)合中心李毓龍教授及其課題組2012級博士畢業(yè)生井淼完成了動物實驗關鍵數(shù)據(jù)。該工作得到了國家自然科學基金委、科技部、北京分子科學國家研究中心以及北大-清華生命科學聯(lián)合中心的資助。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-20754-4

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