PNAS：何川/賈桂芳課題組報(bào)道RNA修飾m6A去甲基酶FTO對多種RNA修飾底物的去甲基分子機(jī)理
近日，北京大學(xué)化學(xué)院的何川/賈桂芳課題組在Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（PNAS）在線發(fā)表了題為 “Structural insights into FTO’s catalytic mechanism for the demethylation of multiple RNA substrates”的研究論文。
FTO對人體發(fā)育至關(guān)重要，F(xiàn)TO酶活功能的紊亂會影響發(fā)育和多種疾病的發(fā)生，包括肥胖和癌癥等。N6-甲基腺嘌呤（m6A）作為mRNA上含量最為豐富的甲基化修飾，是首個(gè)被報(bào)道的FTO去甲基酶活生理底物。之后陸續(xù)報(bào)道FTO生理底物還包括mRNA上5’帽端后的N6，2'-O-二甲基化腺嘌呤（cap m6Am），snRNA的m6A和m6Am，tRNA的N1-甲基腺嘌呤（m1A），除此之外還有體外活性底物單鏈DNA上的N6-甲基脫氧腺嘌呤（6mA）和N3-甲基胸腺嘧啶（3mT）與單鏈RNA上的N3-甲基尿嘧啶（m3U）。FTO如何識別眾多的核酸修飾堿基，是否有催化選擇性，如何結(jié)合多種RNA，F(xiàn)TO為什么對cap m6Am的活性高于單鏈RNA上的m6A，及FTO為什么對單鏈RNA或DNA上的m1A沒有活性卻對tRNA或莖環(huán)結(jié)構(gòu)上的m1A有活性？回答這些FTO的酶催化分子機(jī)制有待于蛋白-核酸復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的解析。然而FTO蛋白與核酸底物結(jié)合力太弱，致使獲得FTO蛋白-核酸復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)一直是該領(lǐng)域的挑戰(zhàn)和難點(diǎn)。
北京大學(xué)化學(xué)學(xué)院何川/賈桂芳課題組巧妙地對FTO蛋白進(jìn)行氨基酸位點(diǎn)突變有效地提升了FTO與核酸的結(jié)合力，同時(shí)不破壞FTO的底物口袋和酶活，首次成功獲得了FTO-核酸復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（圖1）。通過對FTO與6mA修飾的ssDNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析，3mT、m6A、m6Am和m1A核苷分別疊合到FTO-6mA復(fù)合物結(jié)構(gòu)比對分析及體內(nèi)外生化實(shí)驗(yàn)，得出如下結(jié)論：1）相比3mT或m1A等其他甲基化堿基，F(xiàn)TO更偏愛N6-甲基腺嘌呤堿基。FTO活性口袋中的氨基酸R96和E234特異性與N6-甲基腺嘌呤堿基的嘌呤環(huán)形成氫鍵相互作用，同時(shí)多個(gè)氨基酸組成一個(gè)穩(wěn)定的疏水腔用于固定N6-甲基朝向反應(yīng)中心。2）m6A和m6Am擁有相同的N6-甲基腺嘌呤堿基，區(qū)別僅在于糖環(huán)的2’位的甲基。通過結(jié)構(gòu)分析和體外生化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FTO對相同堿基序列的RNA中的m6A和m6Am具有相同的去甲基活性，表明FTO的去甲基活性主要依賴于活性口袋中與N6-甲基腺嘌呤堿基的識別，微弱的糖環(huán)2’位的結(jié)構(gòu)差異并不會造成FTO對m6A和m6Am的活性差異。3）通過結(jié)構(gòu)分析和體外生化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同的RNA堿基序列和RNA三維結(jié)構(gòu)會影響FTO的去甲基活性，F(xiàn)TO更偏向大的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。這幫助解釋了為什么FTO對cap m6Am的活性高于單鏈RNA上的m6A，及為什么FTO對單鏈RNA或DNA上的m1A沒有活性卻對tRNA或莖環(huán)結(jié)構(gòu)上的m1A有活性。該研究工作闡明FTO對不同RNA底物的催化機(jī)理，為深入研究FTO生理功能及開發(fā)FTO小分子抑制劑／激活劑奠定了基礎(chǔ)。
圖1 FTO-6mA核酸復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)及去甲基酶活分子機(jī)制
上述工作主要由北京大學(xué)化學(xué)院何川/賈桂芳課題組的博士研究生張笑、魏連環(huán)、肖雨和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院張良課題組的碩士研究生王雨心等合作完成，同時(shí)得到了北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院湯新景課題組的幫助。賈桂芳和張良為共同通訊作者，該研究得到了國家科技部和國家自然科學(xué)基金委等經(jīng)費(fèi)資助。
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