牛昱宇/季維智課題組在《Science Advances》發(fā)表靈長類單堿基編輯脫靶效應(yīng)評估重要研究成果
7月 22日，我院牛昱宇教授/季維智院士課題組在《Science Advances》（5年IF=15.388）雜志在線發(fā)表了題為“Cloning and base-editing of GFP transgenic rhesus monkey and off-target analysis”（GFP轉(zhuǎn)基因獼猴的克隆、單堿基編輯與脫靶分析）的研究論文。該工作基于體細(xì)胞核移植（SCNT）技術(shù)，建立了一種適用于靈長類動(dòng)物的單堿基編輯器脫靶檢測方法OA-SCNT，并利用該方法對腺嘌呤單堿基編輯器ABEmax在獼猴胚胎DNA、RNA水平的脫靶效應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)評估。
牛昱宇教授、季維智院士為本文通訊作者，學(xué)院在站博士后康宇、王芳，代紹興副教授，博士研究生曾玉強(qiáng)為文章并列第一作者。
單堿基編輯器（base editors）是治療由點(diǎn)突變產(chǎn)生的遺傳性疾病最有效和精確的方法，由于能夠在不依賴DNA雙鏈斷裂（DSB）的情況下實(shí)現(xiàn)對單個(gè)堿基的定向修改，單堿基編輯器能夠最大限度的減少基因編輯中不良產(chǎn)物的產(chǎn)生。然而單堿基編輯器依然存在一定的脫靶效應(yīng)，并由此帶來潛在的安全性問題。由于個(gè)體單核苷酸多態(tài)性（SNP）的存在，單堿基編輯器的脫靶效應(yīng)評估依賴于高靈敏度的檢測技術(shù)，同時(shí)需要有嚴(yán)格的對照樣本，才能夠從全基因組測序數(shù)據(jù)中識別出非 sgRNA依賴的脫靶突變。2019年，《Science》雜志上發(fā)表的兩篇文章分別用不同的方法在水稻和小鼠上證明了單堿基編輯系統(tǒng)存在嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)。由于靈長類動(dòng)物在遺傳和生理上與人類高度相似，在應(yīng)用于臨床之前，基因編輯工具在靈長類動(dòng)物個(gè)體水平的效率和安全性評估顯得尤為重要。
在本項(xiàng)工作中，研究者以一只表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的成年轉(zhuǎn)基因獼猴的體細(xì)胞核作為供體構(gòu)建克隆胚胎。在胚胎早期階段利用單堿基編輯沉默 GFP表達(dá)，并通過胚胎移植得到克隆猴。由于細(xì)胞核來自同一只動(dòng)物，編輯組和對照組樣本的基因背景完全一致，通過比對兩者之間的差異便可鑒定出由基因編輯工具造成的突變。
研究者收集了包含克隆胚胎、克隆猴成體組織在內(nèi)的樣本進(jìn)行全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序，進(jìn)而完成DNA和RNA水平的脫靶分析。在DNA水平，無論是 SNV總數(shù)還是特異的 A > G和T > C突變數(shù)量，編輯組與對照組均沒有顯著差異，說明 ABEmax 系統(tǒng)并沒有引起明顯的 DNA脫靶編輯，這一點(diǎn)與小鼠胚胎的結(jié)果類似。然而 RNA脫靶分析結(jié)果則顯示，在編輯組的獼猴胚胎中出現(xiàn)了顯著增加的 SNVs，且絕大多數(shù)為 A > G和T > C突變，表明 ABEmax會(huì)引起大規(guī)模的 RNA脫靶編輯。在基因表達(dá)總體水平相當(dāng)?shù)那闆r下，脫靶突變更多發(fā)生在表達(dá)量相對較高的基因，并且隨機(jī)分布在不同的轉(zhuǎn)錄本中。此外，分析數(shù)據(jù)表明，98%以上的脫靶突變發(fā)生在蛋白編碼序列，僅 1.9%為長鏈非編碼 RNA（lncRNAs）。研究者進(jìn)一步評估了 RNA脫靶突變的基因與胚胎早期發(fā)育關(guān)鍵基因的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)每個(gè)胚胎中平均有392個(gè)脫靶編輯突變發(fā)生在與胚胎早期發(fā)育相關(guān)的基因，但對基因表達(dá)量沒有影響。此外，每個(gè)編輯組胚胎樣本中平均有 109個(gè)脫靶編輯位點(diǎn)與致癌基因或抑癌基因相關(guān)，同樣，這些基因的表達(dá)量與對照組相比沒有顯著變化，但其蛋白編碼序列有可能被改變。
（上圖：OA-SCNT方法示意圖；下圖：供體猴及克隆猴照片）
綜上，該研究首次成功實(shí)現(xiàn)了成年轉(zhuǎn)基因獼猴的克隆和單堿基編輯，并以此為基礎(chǔ)建立了靈長類動(dòng)物單堿基編輯脫靶分析方法，首次實(shí)現(xiàn)了靈長類個(gè)體水平的單堿基編輯脫靶效應(yīng)評估，將為精準(zhǔn)基因編輯工具的開發(fā)和優(yōu)化提供重要數(shù)據(jù)。同時(shí)，該文章也是牛昱宇/季維智研究團(tuán)隊(duì)繼3 月4 日之后，本年度第二篇發(fā)表在《Science Advances》上的研究論文，兩篇文章均基于靈長類基因編輯技術(shù)展開，為利用靈長類動(dòng)物開展的大腦發(fā)育、疾病發(fā)生機(jī)制和治療研究提供了重要參考。
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