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2022年7月12日,我院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室馬明研究團隊在國際著名期刊Angew. Chem. Int. Ed.上發(fā)表了題為“Crystal structure based mutagenesis of cattleyene synthase leads to the generation of rearranged polycyclic diterpenes”的研究論文。該研究通過解析二萜環(huán)化酶晶體結(jié)構(gòu)揭示復雜四環(huán)二萜cattleyene生物合成機制,并基于晶體結(jié)構(gòu)開展定點突變改變酶的產(chǎn)物結(jié)構(gòu),獲得新骨架二萜化合物。
二萜類天然產(chǎn)物是萜類家族中結(jié)構(gòu)多樣性最強的一類化合物(已發(fā)現(xiàn)大約18000個),且具有多種生物活性。這類化合物的化學骨架多樣性主要歸功于二萜環(huán)化酶的催化,該類酶可以將20個碳原子的通用線裝底物GGPP轉(zhuǎn)化成各種富含手性中心和環(huán)系結(jié)構(gòu)的二萜產(chǎn)物。然而,相對于二萜類化合物的大量發(fā)現(xiàn),二萜環(huán)化酶的結(jié)構(gòu)和催化機制研究大為滯后,尤其是對它們?nèi)绾未呋a(chǎn)生多環(huán)二萜的理解比較欠缺。
Cattleyene(1)是一個新骨架的四環(huán)二萜,具有不同于其它二萜化合物的5/5/6/5環(huán)系結(jié)構(gòu)。馬明團隊針對cattleyene的二萜環(huán)化酶CyS開展了研究,解析了CyS的母體晶體結(jié)構(gòu)(2.00 ?)、CyS與原始底物GGPP的復合物晶體結(jié)構(gòu)(1.87 ?)。該復合物晶體結(jié)構(gòu)首次揭示了原始底物GGPP在二萜環(huán)化酶活性口袋中的結(jié)合信息,而不是文獻報道中的GGPP類似物的結(jié)合信息。進一步深入分析發(fā)現(xiàn)CyS活性口袋中的多個芳香性氨基酸可以通過cation-π相互作用穩(wěn)定碳正離子中間體,分子對接實驗揭示了CyS從結(jié)合GGPP到生成cattleyene的完整環(huán)化過程。
圖1. 四環(huán)二萜cattleyene的結(jié)構(gòu)、二萜環(huán)化酶CyS晶體結(jié)構(gòu),以及GGPP在CyS中的結(jié)合
研究團隊開展了定點突變研究,驗證了CyS活性口袋中的關(guān)鍵氨基酸殘基的功能。關(guān)鍵殘基的突變導致無法穩(wěn)定碳正離子中間體,使得生物合成流向上游旁路路徑,產(chǎn)生不同骨架的二萜產(chǎn)物。出乎意料的是,一個遠離GGPP結(jié)合口袋的突變C59A除了產(chǎn)生cattleyene外,還產(chǎn)生了5個不同環(huán)系新產(chǎn)物(化合物2-5)。研究團隊進而解析了CySC59A突變體的晶體結(jié)構(gòu)(2.30 ?),揭示了半胱氨酸C59雖然不與底物GGPP直接相互作用,但是其突變?yōu)楸彼岷罂臻g位阻減小,松弛了活性口袋,使得突變后的酶能夠更快地結(jié)合底物并催化反應(yīng),但同時失去了只產(chǎn)生cattleyene一個產(chǎn)物的專一性。
圖2. ?CyS定點突變產(chǎn)生不同骨架的二萜產(chǎn)物
鑒于突變體產(chǎn)物化合物6是一個新骨架四環(huán)二萜,它的環(huán)化機制無法通過經(jīng)驗進行簡單的推測,因此研究團隊通過一系列13C 和2H的同位素標記實驗,揭示了化合物6形成中所經(jīng)歷的多種骨架重排和氫負離子遷移的過程。
該研究不僅推進了對四環(huán)二萜環(huán)化酶催化機制的理解,也為復雜環(huán)系二萜的合成生物學制備提供了依據(jù)。該項工作得到科技部重點研發(fā)計劃和國家自然科學基金委等資助。北京大學藥學院博士生邢佰穎、德國波恩大學Houchao Xu為本論文共同第一作者,北京大學藥學院馬明研究員、楊東輝副教授,波恩大學Jeroen S. Dickschat教授為共同通訊作者。
原文鏈接:https://doi.org/10.1002/anie.202209785
第一作者:
邢佰穎 博士生
通訊作者簡介:
馬明,北京大學藥學院、天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室研究員,博士生導師,長聘副教授。研究領(lǐng)域為天然藥用功能分子的生物合成,酶的三維結(jié)構(gòu)及其催化機制,以及天然產(chǎn)物合成生物學。近5年以通訊作者在Angew. Chem. Int. Ed.、JACS、ACS Catal.、Chem. Sci.、Commun. Chem.、Org. Lett.、J. Biol. Chem.、J. Org. Chem.、J. Nat. Prod.等國際學術(shù)期刊發(fā)表論文15篇。任中國藥學會海洋藥物專業(yè)委員會委員、中華中醫(yī)藥學會青年委員會委員、北京藥學會天然藥物專業(yè)委員會委員。
楊東輝,北京大學藥學院副教授,研究方向為天然藥源分子的發(fā)現(xiàn)與生物合成。以通訊作者在Commun. Chem.、Org. Lett.、J. Org. Chem.、J. Nat. Prod.、Appl. Microbiol. Biotechnol.、Mar. Drugs等本領(lǐng)域權(quán)威期刊發(fā)表學術(shù)論文28篇。擔任世中聯(lián)中藥化學專業(yè)委員會常務(wù)理事、中西醫(yī)結(jié)合學會分子生藥學專業(yè)委員會委員、中國民族醫(yī)藥學會藥用資源委員會理事。
天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室 供稿
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