李子剛/尹豐課題組基于锍鹽分子的“基團轉移”策略獲得重要進展
近日，北京大學深圳研究生院李子剛/尹豐課題組在中國化學會旗艦期刊《CCS Chemistry》發(fā)表了題為“A proximity-triggered strategy towards transferable PROTACs”的研究論文。該論文通過配體導向化學，開發(fā)了一種基于锍鹽分子的“基團轉移”策略用于靶標蛋白半胱氨酸（Cysteine，Cys）的位點選擇性修飾。“基團轉移”策略成功地用于PROTAC領域顯示出該策略的實用性，當作者將“轉移基團”稍加改造，該策略即可被用于更多化學生物學的研究，諸如PTM研究，活細胞成像以及蛋白質組學研究等等。
圖一、基于硫鹽中心的“基團轉移”策略用于“可轉移PROTAC”示意圖
EGFR是NSCLC診斷和治療研究的最重要藥物靶點之一。EGFR-TKIs雖然對治療NSCLC有顯著療效，但其維持時間短，絕大多數EGFR TKIs治療有效的患者最終都會復發(fā)耐藥，成為了當前臨床肺癌治療面對的巨大挑戰(zhàn)。PROTAC是藥物研發(fā)領域的一個新興方向，其目的不是抑制靶標而是誘導靶標蛋白通過UPS（泛素-蛋白酶體系統(tǒng)）被降解，為解決小分子抑制劑的耐藥性問題帶來了希望。PROTACs由三部分組成，通過中間的連接基團將一個靶標蛋白的配體和一個特異性招募E3連接酶的配體連到一起。因此，PROTACs可以同時結合目標蛋白和E3連接酶，進而形成目標蛋白-PROTACs-E3連接酶三元復合物。PROTACs劫持E3連接酶，將目標蛋白多聚泛素化，通過UPS選擇性降解目標蛋白。然而傳統(tǒng)PROTACs分子的設計合成比較繁瑣，為其后續(xù)的生物研究以及臨床應用帶來困難。
李子剛/尹豐課題組前期發(fā)展了一種側鏈硫鹽穩(wěn)定多肽對蛋白質定點修飾策略。由此出發(fā)，作者設想能否將锍鹽中心引入到PROTACs分子的設計當中，發(fā)展一種簡單易得，適用于任何“蛋白質-抑制劑”系統(tǒng)的锍鹽工具用于快速判斷特定靶標的降解效率。于是作者在Osimertinib配體上引入锍鹽中心，希望在Osimertinib導向下，通過鄰近靶標Cys對硫鹽中心的親核進攻，發(fā)生基團轉移反應，將锍鹽中心上的功能基團Thalidomide轉移到靶標蛋白上，形成“靶標-Thalidomide”偶聯(lián)物，實現(xiàn)UPS誘導的EGFR降解。
首先，作者對锍鹽的合成進行了簡單摸索，Osimertinib和硫醇通過邁克爾加成生成硫醚，接著在弱酸性下與芐基溴取代生成锍鹽分子。化學上，作者通過原位NMR確定了高濃度的芐基二甲基锍鹽（10 mM）和Ac-Cys-OH（50 mM）之間的反應性。Ac-Cys-OH上親核性巰基能進攻芐基二甲基锍鹽上的芐基，發(fā)生“基團轉移”反應，得到芐基化Ac-Cys-OH產物。于是，作者合成了一系列帶有芐基接頭的锍鹽，探索其和重組EGFR的反應。膠內熒光實驗和DFT計算都驗證了帶有芐基的疊氮基團轉移到重組EGFR上。除了簡單的正交基團，帶有芐基接頭的Cy5熒光基團也能被轉移到重組EGFR上。為了探究基團轉移反應的化學特性，作者合成了帶有其他接頭的生物素硫鹽，通過WB驗證芐基接頭表現(xiàn)出較好的轉移效率。競爭實驗說明導向配體對靶標的識別對“基團轉移”反應的發(fā)生與否至關重要。不同激酶的WB結果驗證了反應的靶標選擇性。最后，LC-MS/MS確定了1-IX可以位點選擇性標記重組EGFR的Cys775。
為了探究該基團轉移策略能否適用于PROTAC領域，作者合成了帶有CRBN配體的锍鹽降解子1-X。通過WB發(fā)現(xiàn)1-X對EGFR的降解效果隨著藥量和時間的增加而加強。由于1-X跟EGFR結合后才會觸發(fā)基團轉移反應，而通常認為EGFR的降解在結合階段就能發(fā)生，為了進一步探究降解發(fā)生的原因，作者合成了幾個對照分子。沒有EGFR結合配體的5以及沒有CRBN結合配體的8無法降低EGFR表達水平，更重要的是，擁有雙配體的硫醚分子6、1-X水解產物7和9未能降解EGFR證實了EGFR的降解是通過轉移Thalidomide基團引起的。
為了驗證降解是由CRBN介導的，作者用帶有甲基化修飾的Thalidomide（1-XIII）和帶有芐基化修飾的Thalidomide（1-XIV）作為陰性對照處理A549細胞。陰性對照未能降解EGFR，這證實了EGFR的降解是由CRBN介導的。為了探究1-X誘導EGFR降解是否通過泛素-蛋白酶體途徑，作者用MLN-4924抑制劑或Thalidomide競爭劑預處理細胞后EGFR沒有降解，說明降解是由E1和E3介導的。作者將帶有HA標簽的泛素表達質粒瞬時轉染到A549細胞中，并加藥處理細胞，免疫沉淀（IP-WB）檢測泛素化EGFR蛋白。1-X處理樣品的泛素化EGFR水平高于沒有1-X處理的樣品，說明1-X介導的EGFR降解伴隨著EGFR的泛素化。進一步得，作者發(fā)現(xiàn)加入蛋白酶體抑制劑MG-132可以減緩1-X誘導的EGFR的降解，說明該降解是通過蛋白酶體途徑發(fā)生的。綜上表明1-X誘導的EGFR降解是通過“泛素-蛋白酶體”途徑發(fā)生的。最后，作者通過RT-PCR表明1-X誘導的EGFR降解是發(fā)生在蛋白質水平的。
為了探究硫鹽分子的生物學功能。作者通過HTRF確定1-IX可以抑制EGFR磷酸化。由于EGFR磷酸化被抑制會阻斷EGFR信號傳導通路，從而會抑制腫瘤細胞的生長。于是作者通過MTT驗證了1-IX/1-X對肺癌細胞的生長有抑制作用。1-X抑制肺癌細胞生長可能是由于1-X誘導的EGFR降解導致的。細胞周期和細胞凋亡實驗說明了1-IX/1-X誘導了肺癌細胞的G0/G1周期停滯和中后期凋亡。為了擴展基團轉移策略的普適性，作者合成了帶有Adamantane功能基團的锍鹽分子1-XV。通過另一種蛋白降解策略（HyT）使用疏水標簽來模擬部分變性的蛋白質折疊狀態(tài)，從而誘導分子伴侶介導蛋白酶體降解。1-XV對EGFR的降解效果隨著時間和藥量的增加而加強。
總之，通過配體導向的鄰近效應，作者開發(fā)了一種基于锍鹽中心的“基團轉移”策略對蛋白質Cys進行位點選擇性修飾，該策略成功應用于PROTACs領域實現(xiàn)了UPS途徑的EGFR靶向降解。該可轉移PROTACs和其他共價PROTACs都沒法實現(xiàn)催化再循環(huán)，這導致了至少化學計量的濃度才能誘導靶標蛋白質降解。然而，受益于共價連接的可轉移PROTAC策略能增加降解的靶標親和力以及動力學優(yōu)勢?？赊D移的PROTAC策略僅需要通過簡單的配體組裝，用于快速判斷特定靶標的降解效率。作者相信，出于不同的目的，不同的功能基團可以選擇性標記到靶標上，用于模擬PTM修飾、活細胞成像以及化學蛋白質組學研究等。
北大深研院的王躍娜博士，萬川博士和趙融通博士完成了實驗的主要部分，深圳灣實驗室的康微博士，王蕊博士，深圳大學的江承堯博士對本論文做出了重要貢獻。論文得到了國家自然科學基金，國家博士后基金，國家重點研發(fā)計劃“合成生物學”重點專項，廣東省自然科學基金，深圳市科技創(chuàng)新委員會的支持。
論文鏈接https://doi.org/10.31635/ccschem.022.202201985
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