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近期，北京大學化學與分子工程學院雷曉光教授與北京大學生命科學學院肖俊宇研究員、南方科技大學田瑞軍教授在eLife雜志上發(fā)表了最新合作研究成果“Selective inhibition reveals the regulatory function of DYRK2 in protein synthesis and calcium entry”。該工作報道了新一代高活性、高選擇性DYRK2激酶小分子抑制劑的開發(fā)，以及利用該抑制劑作為工具分子通過化學生物學手段首次揭示了該激酶對蛋白合成及鈣內(nèi)流的關鍵調(diào)控作用。

人體雙特異性酪氨酸-磷酸化調(diào)控激酶DYRKs是進化保守的激酶家族，以對其自身的酪氨酸殘基和其他蛋白的絲氨酸/蘇氨酸位點具有激酶活性為主要特點。DYRKs屬于絲氨酸/蘇氨酸CMGC激酶家族，共有五個成員。DYRK2是DYRKs家族的主要成員之一，但其生理功能尚未被完全揭示。近期研究表明雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)控激酶2(DYRK2)是一個蛋白酶體調(diào)控激酶。抑制DYRK2激酶能夠顯著降低蛋白酶體活性，導致小鼠異種移植模型中腫瘤細胞周期進展受阻、生長減緩。

在前期研究中，雷曉光、肖俊宇課題組與合作者報道了DYRK2特異性小分子抑制，LDN192960 （PNAS 2019）。晶體結(jié)構解析和生化研究揭示了LDN192960 選擇性抑制DYRK2的分子機制。LDN192960能夠通過抑制DYRK2的活性而降低蛋白酶體活性，從而緩解三陰性乳腺癌和多發(fā)性骨髓瘤的進展，表明靶向DYRK2有望成為治療這兩種腫瘤的有效方案。雖然LDN192960對于DYRK2有較好的選擇性和抑制性，但是它還可以抑制其他相關激酶，包括Haspin和DYRK3。

為了消除脫靶激酶的影響，該工作通過基于結(jié)構的藥物設計，在基于吖啶的核心結(jié)構基礎上設計、合成和評估了一系列新型吖啶類似物，并解析了11個新型小分子抑制劑與DYRK2的共晶結(jié)構。其中化合物17(C17)表現(xiàn)突出，對DYRK2具有納摩級別的半抑制濃度(IC50)，并對其他468個人體激酶沒有明顯的活性。此外，C17還有效的抑制了細胞中DYRK2的活性。因此，C17是一種高效且極具選擇性的DYRK2抑制劑。

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圖1 C17是一個高活性、高選擇性的DYRK2小分子抑制劑

為了發(fā)現(xiàn)DYRK2新的生物學功能，該工作將C17作為一個特異而有效的探針，來研究哪些蛋白或信號通路受到DYRK2調(diào)控的影響。通過使用無標記的定量磷蛋白組學方法研究了C17處理后細胞磷酸化蛋白組的變化。在此，該研究通過對DYRK2的mRNA含量測序，尋找了一株在內(nèi)源DYRK2基因高表達的骨髓瘤細胞系(U266)進行磷酸化蛋白質(zhì)組學分析。結(jié)果表明，DYRK2參與復雜的磷酸化網(wǎng)絡，通過直接、間接的作用調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。在顯著下調(diào)的位點中，該工作重點關注了兩個重要的潛在底物蛋白，真核翻譯起始因子結(jié)合蛋白1(4E-BP1)和基質(zhì)相互作用分子1(STIM1)。

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圖2 基于C17的定量磷酸化蛋白質(zhì)組學分析

4E-BP1是轉(zhuǎn)錄過程的重要調(diào)節(jié)因子，已有研究表明是DYRK2的潛在底物。該研究通過建立體外激酶活性體系，驗證了DYRK2可以直接磷酸化4E-BP1上的多個位點（包括質(zhì)譜鑒定到的位點Thr37），并且C17以劑量依賴性的方式抑制這些位點。此外，4E-BP1受多種激酶的共同調(diào)節(jié)，進一步研究表明，當C17與AKT、MEK抑制劑聯(lián)用時，可以更高效地抑制蛋白磷酸化水平，表現(xiàn)出不同抑制劑之間的協(xié)同效應。總之，通過大量的體內(nèi)外實驗驗證，結(jié)果表明4EBP1是DYRK2的直接底物，并揭示了DYRK2 抑制劑與其他激酶抑制劑聯(lián)合用于癌癥治療的潛在用途。

STIM1是已知的磷酸化蛋白，其磷酸化可以調(diào)控鈣庫操縱的鈣內(nèi)流過程(SOCE)。該研究同樣驗證了DYRK2在蛋白水平、細胞內(nèi)都可以有效的磷酸化STIM1，這些結(jié)果表明STIM1中可能存在多個DYRK2磷酸化位點。據(jù)此，該研究進一步通過質(zhì)譜鑒定到DYRK2作用STIM1的具體位點，包括U266磷酸化蛋白組分析中確定的Ser519和Ser521。為了進一步驗證DYRK2對STIM1的磷酸化修飾的功能，通過Co-IP、FRET體系驗證了DYRK2通過對STIM1的磷酸化修飾增強其與Orai1之間的結(jié)合能力，而DYRK2-D275N，STIM1-1-491以及STIM1-10M則不能，且處理C17則可以減弱STIM1和Orai1的相互作用。進一步研究證明，DYRK2磷酸化可以促進STIM1寡聚，增強與Orai1的相互作用，進而誘導SOCE過程。

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圖4 DYRK2磷酸化STIM1并參與調(diào)控鈣庫操縱的鈣內(nèi)流過程

該研究結(jié)合結(jié)構生物學與化學生物學方法，系統(tǒng)研究和開發(fā)了一系列新型DYRK2激酶小分子抑制劑。這些研究為靶向DYRK2的藥物開發(fā)提供了實驗數(shù)據(jù)和理論參考，也更加拓展了對DYRK2生物學功能的理解，為其后續(xù)研究提供了有力的分子工具。

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該工作中，北京大學魏田田博士、王玨博士、梁如琪博士以及南方科技大學陳文東博士為該論文的共同第一作者，北京大學雷曉光教授和肖俊宇研究員，以及南方科技大學田瑞軍教授為文章的共同通訊作者。北京師范大學博士研究生陳一蘭、北京大學博士研究生曾欣、杜逸飛博士、南方科技大學何岸博士、北京大學周文靜博士、浙江大學郭行教授、北京大學陳曉偉研究員、北京大學王初教授以及北京師范大學王友軍教授對該工作提供了幫助。該工作的晶體篩選在北京大學鳳凰工程蛋白質(zhì)平臺完成，晶體數(shù)據(jù)收集在上海同步輻射光源和日本KEK同步輻射光源完成。該工作主要得到國家科技部重點研發(fā)計劃-蛋白質(zhì)機器專項，國家自然科學基金委-“生物大分子動態(tài)修飾與化學干預”重大研究計劃，北京市卓越青年科學家計劃，北京分子科學國家研究中心，北大-清華生命科學聯(lián)合中心等科研基金的資助。

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原文鏈接：https://elifesciences.org/articles/77696

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