黃碩課題組JACS: 電滲流納米勢阱實現(xiàn)蛋白質(zhì)高分辨識別
分子水平的蛋白質(zhì)識別在疾病的早期診斷和治療中具有重要的意義。一般來說，蛋白質(zhì)可以通過質(zhì)譜和免疫分析等手段進行鑒定。隨著研究的深入，人們對蛋白質(zhì)的分析已從對一級序列的研究延伸到通過觀測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化來理解蛋白質(zhì)的功能。然而，低豐度的蛋白質(zhì)病理變化很可能被宏觀手段所獲得蛋白質(zhì)集成信息所掩蓋，無法捕捉到單個蛋白質(zhì)的異常結(jié)構(gòu)特征。目前開發(fā)一種能夠識別不同的蛋白質(zhì)，并區(qū)分由配體/藥物結(jié)合和融合等過程引起的單個蛋白質(zhì)的不同結(jié)構(gòu)狀態(tài)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，仍然是基礎(chǔ)研究中的一個挑戰(zhàn)。
納米孔作為一種單分子蛋白質(zhì)傳感手段的優(yōu)勢正在逐漸顯現(xiàn)。許多工作已經(jīng)證明納米孔能夠以單分子分辨率對蛋白質(zhì)進行識別和結(jié)構(gòu)動力學(xué)直接分析。然而蛋白質(zhì)與核酸不同，其表面電荷分布和整體帶電性質(zhì)差異較大，難以在統(tǒng)一的測試環(huán)境下都獲得足夠的捕獲效率，這使得同時感知不同電荷蛋白質(zhì)的傳感器設(shè)計變得復(fù)雜。近年來，研究者通過工程化改造納米孔內(nèi)電荷分布的策略增加電滲透（EOF）作用，已經(jīng)開發(fā)了一系列適合蛋白質(zhì)分析的生物納米孔道例如溶細(xì)胞素A（ClyA），曲霉毒素C（FraC）和胸膜溶素AB（PlyAB）。但這種策略可能影響待測蛋白和納米孔的形狀和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，影響分析效率。同時，以上傳感系統(tǒng)均暫未實現(xiàn)生物樣品的直接檢測。?
圖1. 機器學(xué)習(xí)輔助MspA納米勢阱同時檢測不同電荷蛋白質(zhì)
最近，我院黃碩教授課題組提出了一種簡單有效的方案，將KCl/CaCl2不對稱電解質(zhì)緩沖液與恥垢分枝桿菌孔蛋白A (MspA) 檢測系統(tǒng)相結(jié)合構(gòu)建電滲透(EOF)納米勢阱。這種方法可以將納米孔對蛋白質(zhì)的捕獲效率提高7~18倍，且分析時間延長達159倍，極大程度提高了納米孔解析蛋白質(zhì)的能力。使用這種MspA勢阱，天然肌紅蛋白（holo-MB）和其脫輔基狀態(tài)(apo-MB)之間的結(jié)構(gòu)差異可以被清晰的分辨；另外，兩種天然無序蛋白（ATCR和NCBD）形成復(fù)合物前后的結(jié)構(gòu)差異也可以在單分子尺度被清晰的表征。更重要的是，堿性的溶菌酶(pI=11)、中性的apo/holo-肌紅蛋白（pI=8.5 和7.3）和酸性的ACTR/NCBD復(fù)合物（pI=5.75）可在pH=7.0的測試環(huán)境下被同時傳感。這是納米孔分析策略中首次實現(xiàn)不同電荷性質(zhì)的蛋白質(zhì)的同時檢測。
圖2. MspA納米勢阱鑒別乳清蛋白粉中的ɑ-乳白蛋白和β-乳球蛋白
進一步，為了實現(xiàn)混合傳感事件分類的自動化，作者提取了蛋白質(zhì)對離子流阻塞的七個特征構(gòu)建了機器學(xué)習(xí)分類模型，對不同蛋白質(zhì)的鑒定準(zhǔn)確率可達到99.9%。這種機器學(xué)習(xí)輔助的MspA納米勢阱可以被用于直接從市售乳清蛋白粉中快速鑒定并定量其中的ɑ-乳白蛋白和β-乳球蛋白，無需對樣品做任何的純化預(yù)處理步驟，樣品濃度0.4 μg/mL即可測試。驗證了該策略在從混合物中蛋白質(zhì)標(biāo)記物的快速、高靈敏度檢測和實時結(jié)構(gòu)分析方面的具有非常好的應(yīng)用前景，為納米孔的蛋白質(zhì)無標(biāo)簽直接分析提供了新的思路。
該工作以“Machine Learning Assisted Simultaneous Structural Profiling of Differently Charged Proteins in a Mycobacterium smegmatis?Porin A (MspA) Electroosmotic Trap”為題，于2022年1月7日發(fā)表于《美國化學(xué)學(xué)會期刊》（文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c09259，DOI：https://doi.org/10.1021/jacs.1c09259）我院博士生劉瑤為該論文的第一作者，我院黃碩教授為論文通訊作者，我院陳洪淵院士對該工作做出了重要指導(dǎo)。此項研究得到了生命分析化學(xué)國家重點實驗室以及南京大學(xué)化學(xué)和生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院(ChemBIC)的重要支持，國家自然科學(xué)基金（項目編號：31972917, 91753108, 21675083）、中央高校基本科研業(yè)務(wù)費資助項目(項目編號：020514380257, 020514380261)、江蘇省高層次創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新人才引進計劃（個人、團體計劃）、江蘇省自然科學(xué)基金（項目編號：BK20200009）、南京大學(xué)生命科學(xué)分析化學(xué)國家重點實驗室(項目編號：5431ZZXM1902)、南京大學(xué)科技創(chuàng)新基金資助項目、中國博士后科學(xué)基金資助項目(項目編號：2021M691508)等提供了經(jīng)費支持。
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