Nature | 生命中心毛有東團隊發(fā)表突破性研究成果——人工智能助力時間分辨冷凍電鏡發(fā)現(xiàn)重大藥物靶點動力學(xué)調(diào)控機制
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生命分子機器通過高度復(fù)雜的非平衡動力學(xué)過程和結(jié)構(gòu)變化來實現(xiàn)其特殊功能，這一過程進而受到各種復(fù)雜分子間相互作用的精準調(diào)控。如何在原子水平直接觀察天然態(tài)超大分子機器的功能態(tài)動力學(xué)過程給現(xiàn)有的原子結(jié)構(gòu)動態(tài)分析技術(shù)提出了空前挑戰(zhàn)。精準觀察生命分子機器的功能復(fù)合動力學(xué)對于靶向藥物設(shè)計提供了傳統(tǒng)技術(shù)難以獲取的復(fù)合物動態(tài)標底，將推動新一輪原研藥重大創(chuàng)新。
2022年4月27日，北京大學(xué)物理學(xué)院、介觀物理國家重點實驗室、國家生物醫(yī)學(xué)成像科學(xué)中心、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、北大定量生物學(xué)中心毛有東團隊在國際頂級學(xué)術(shù)期刊《自然》雜志在線發(fā)表了題為“USP14-regulated allostery of the human proteasome by time-resolved cryo-EM”的研究論文，報道了利用自主研發(fā)的深度學(xué)習高精度四維重建技術(shù)，發(fā)展并應(yīng)用時間分辨冷凍電鏡，闡明原子水平人源蛋白酶體動力學(xué)調(diào)控和構(gòu)象重編程機制的突破性科學(xué)發(fā)現(xiàn)。這是國際上首次將人工智能四維重建技術(shù)用于大幅提升時間分辨冷凍電鏡分析精度，針對重大疾病靶標復(fù)合體，實現(xiàn)原子水平動力學(xué)觀測的國際領(lǐng)先原創(chuàng)一流成果，展示了一類新型的蛋白質(zhì)復(fù)合動力學(xué)研究范式?！蹲匀弧吠谠诰€發(fā)表了題為“Control of human protein-degradation machinery revealed”的Research Briefing專欄推介文章，發(fā)表了審稿人和Nature編輯團隊的官方點評，其中審稿人評價“該工作是一項重大研究，終于在原子水平解決了USP14活化和其調(diào)控蛋白酶體功能的機制問題”，Nature編輯團隊指出“這一工作通過時間分辨冷凍電鏡，結(jié)合功能分析，……，呈現(xiàn)了蛋白質(zhì)降解過程中USP14和蛋白酶體的構(gòu)象連續(xù)體”。
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蛋白質(zhì)降解調(diào)控是極其重要的基本生物化學(xué)過程，在細胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫響應(yīng)、基因調(diào)控、新陳代謝、神經(jīng)退行、癌癥腫瘤、病毒感染以及蛋白毒性響應(yīng)等主要細胞分子過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。在真核細胞中，絕大部分胞內(nèi)蛋白都是通過泛素蛋白酶體途徑（Ubiquitin-proteasome pathway），經(jīng)過泛素化標記被蛋白酶體全酶降解的。2004年，Aaron Ciechanover, Irwin Rose和Avram Hershko三位科學(xué)家被授予了諾貝爾化學(xué)獎，以表彰他們對該泛素化通路介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解的歷史性發(fā)現(xiàn)。蛋白酶體全酶，又稱為26S proteasome，是由中間一個圓柱形20S核心顆粒和兩端覆蓋的一個或兩個19S調(diào)節(jié)顆粒組成。19S包含一個環(huán)形異源六聚體馬達——AAA-ATPase，通過多個協(xié)同ATP水解模式調(diào)控蛋白酶體降解泛素化底物。蛋白酶體功能紊亂與人體多種疾病相關(guān)，如癌癥、神經(jīng)退行性疾病和免疫疾病等。蛋白酶體是美國FDA批準的多種治療癌癥的上市小分子藥物的直接靶標。在正常細胞中，蛋白酶體的功能受到多個水平的嚴格調(diào)控。去泛素化酶USP14是最主要的蛋白酶體調(diào)控分子，被認為是一個潛力巨大的治療癌癥和神經(jīng)退行性疾病的重要靶標，其小分子抑制劑曾進入過美國一期臨床研究，但圍繞USP14功能機制的一系列懸而未決的關(guān)鍵問題極大限制了其靶向藥物分子的開發(fā)和臨床應(yīng)用。USP14通過結(jié)合26S而被激活，然后以毫秒的時間尺度剪切底物上的泛素鏈。它是如何被蛋白酶體激活并調(diào)控蛋白酶體功能的，一直是全球研究機構(gòu)和生物制藥界期待解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。
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北京大學(xué)毛有東實驗室長期致力于發(fā)展基于冷凍電鏡的動力學(xué)重建方法及其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，圍繞蛋白酶體、炎癥小體等具有重大臨床應(yīng)用前景的靶點系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)功能、動力學(xué)機制和靶向調(diào)控分子設(shè)計深入開展前沿交叉研究。2016年報道了人源蛋白酶體基態(tài)的3.6?冷凍電鏡結(jié)構(gòu)及其他三個亞納米分辨構(gòu)象，并首次發(fā)現(xiàn)一個亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)象的核心顆粒物轉(zhuǎn)運通道處于開放狀態(tài)（PNAS2016; 113: 12991-12996）。2017年，利用冷凍電鏡解析高分辨率人源蛋白酶體19S調(diào)控復(fù)合體在結(jié)合組裝伴侶p28的自由態(tài)的三維結(jié)構(gòu)，闡釋了組裝伴侶蛋白Gankyrin/p28在蛋白酶體組裝過程中構(gòu)象選擇的組裝機理（MolecularCell 2017; 67: 322-333）。2018年4月，報道了6個ATPγS結(jié)合狀態(tài)下的26S蛋白酶體動態(tài)結(jié)構(gòu)，包括三個核心顆粒復(fù)合物開放態(tài)對應(yīng)的亞穩(wěn)簡并態(tài)近原子分辨（4~5?）結(jié)構(gòu)（Nature Communications 2018, 9: 1360）。2018年11月，在《自然》首次報道了人源蛋白酶體26S在降解底物過程中的七種中間態(tài)構(gòu)象的高分辨（2.8~3.6埃）結(jié)構(gòu)，在原子水平呈現(xiàn)了蛋白酶體和底物相互作用的動態(tài)過程，首次實現(xiàn)了對AAA-ATPase六聚馬達分子內(nèi)ATP水解全周循環(huán)的完整過程的原子水平觀測（Nature 2019; 565:49-55）。這一系列工作揭示了蛋白酶體的原子架構(gòu)、組裝原理和降解泛素化底物的動力學(xué)基本規(guī)律。
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圖1.(A)USP14調(diào)控下蛋白酶體復(fù)合體降解多泛素化底物的原子結(jié)構(gòu)模型之一。(B)時間分辨率冷凍電鏡解析13種中間態(tài)的統(tǒng)計分布隨蛋白質(zhì)降解進程的時間演化。（圖片來源: YoudongMao, CC BY 4.0）
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科學(xué)研究的過程總是布滿坎坷。本研究課題進行之初，首先要克服的問題就是“時間分辨”。蛋白酶體降解底物的過程是很快的，時間尺度在毫秒至秒之間。正常條件下，想要通過冷凍電鏡技術(shù)捕獲此過程的中間態(tài)結(jié)構(gòu)，是非常困難的。所以，課題組首先要讓這個過程慢下來。通過大量的條件摸索，重建反應(yīng)動力學(xué)體系和優(yōu)化反應(yīng)條件，包括優(yōu)化緩沖體系、反應(yīng)溫度等條件，課題組優(yōu)化出較為可行的實驗方案，從而使得時間分辨冷凍電鏡技術(shù)應(yīng)用成為可能，最終獲得了含時的45,193張USP14-26S復(fù)合體降解泛素底物過程中的冷凍電鏡透射圖樣，挑取了3,556,806個USP14-26S-泛素底物復(fù)合體的顆粒圖像。接下來面臨的極端挑戰(zhàn)就是“三維分類”，冷凍電鏡捕獲的復(fù)合體圖像需要經(jīng)過一系列的分類，將它們歸為不同的構(gòu)象類別，才能呈現(xiàn)出蛋白反應(yīng)的動態(tài)過程。USP14結(jié)合到26S蛋白酶體后，使得降解底物的動力學(xué)過程更加復(fù)雜，想要在如此多的異構(gòu)復(fù)合體顆粒圖像中，鑒別出降解過程的各個時態(tài)的高分辨率非平衡構(gòu)象，傳統(tǒng)的三維分類方法是無法實現(xiàn)的。低精度的三維分類將導(dǎo)致低分辯的三維重建，從而無法獲取原子水平的動力學(xué)信息，無法對含時的數(shù)據(jù)賦予自洽的動態(tài)變化的物理意義。課題組結(jié)合經(jīng)過數(shù)年自主開發(fā)的新型深度學(xué)習高精度三維分類和四維重建方法，捕獲了USP14-26S復(fù)合體降解多泛素化底物過程的13種不同功能中間狀態(tài)的高分辨率（3.0~3.6埃）非平衡構(gòu)象，通過時間分辨冷凍電鏡分析，重建了受控蛋白酶體的完整動力學(xué)工作周期，并結(jié)合分子生物學(xué)功能和基因突變研究，闡明了USP14和26S相互調(diào)控活性的原子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和非平衡動力學(xué)機制。
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研究發(fā)現(xiàn)USP14的活化同時依賴于泛素識別和蛋白酶體RPT1亞基的結(jié)合。出人意料的是，USP14通過別構(gòu)效應(yīng)，誘導(dǎo)蛋白酶體同時沿著兩條并行狀態(tài)轉(zhuǎn)變路徑發(fā)生構(gòu)象變化；課題組成功捕獲到了底物降解中間狀態(tài)向底物抑制中間狀態(tài)的瞬時轉(zhuǎn)化。在底物降解途徑中，USP14活化變構(gòu)地重編程AAA-ATP酶馬達的構(gòu)象景觀（Conformationallandscape）和統(tǒng)計分布，并刺激20S底物通道的打開，從而觀察到底物持續(xù)轉(zhuǎn)運過程的ATPase六聚馬達非對稱ATP水解和近乎完整的全周循環(huán)周期。USP14-ATPase的動態(tài)相互作用，使得ATPase馬達底物識別與26S自身的去泛素化酶RPN11催化發(fā)生去耦合效應(yīng)，并在26S的泛素識別、底物的起始易位和泛素鏈回收過程中引入三個調(diào)控檢查點（動力學(xué)分岔點）。這些發(fā)現(xiàn)為USP14調(diào)節(jié)26S的完整功能周期提供了全新的高分辨見解，并為USP14靶向藥物治療發(fā)現(xiàn)奠定了極為重要的機制基礎(chǔ)。
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圖2.通過時間分辨冷凍電鏡分析獲取的USP14調(diào)控蛋白酶體底物降解的并行路徑模型。（圖片來源: YoudongMao, CC BY 4.0）
課題組博士后張書文與2019級博士生鄒士濤為本論文的共同第一作者，毛有東為通訊作者。該論文的全部冷凍電鏡數(shù)據(jù)在北大電子顯微鏡實驗室和冷凍電鏡平臺上完成采集，大部分數(shù)據(jù)分析工作在北大高性能計算平臺上完成。這項工作得到了北京市自然科學(xué)基金委員會重點專項、國家自然科學(xué)基金面上項目、國家杰出青年科學(xué)基金、國家重點實驗室和北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心的支持。
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Nature論文在線鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41586-022-04671-8
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