Angew. Chem. Int. Ed. | 光催化的化學(xué)交聯(lián)用于活細(xì)胞中RNA相互作用蛋白的捕獲
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4月22日，生命中心、北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院陳鵬、鄒鵬與北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院樊新元合作在Angew. Chem. Int. Ed.發(fā)表題為“Photocatalytic Chemical Crosslinking for Profiling RNA-Protein Interactions in Living Cells”的研究論文。
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細(xì)胞中的RNA-蛋白質(zhì)相互作用在體內(nèi)受到精密的調(diào)控，對于RNA剪接、細(xì)胞定位、翻譯以及降解等生物學(xué)過程至關(guān)重要。RNA-蛋白質(zhì)相互作用的擾動會導(dǎo)致細(xì)胞功能缺陷進(jìn)而引發(fā)包括神經(jīng)退行性疾病在內(nèi)的多種嚴(yán)重疾病。因此，RNA相互作用蛋白（RBP）的分析有助于揭示與疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制，具有較高的研究價值。傳統(tǒng)的分析方法主要是通過紫外交聯(lián)使蛋白與RNA之間形成共價鍵的方式來獲得RNA結(jié)合蛋白，但是紫外線照射會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，同時該方法的標(biāo)記效率有待提高。為了解決這個問題，科學(xué)家們發(fā)展了基于鄰近標(biāo)記的RNA結(jié)合蛋白分析策略，但是這種方法需要對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，不適用于包括免疫細(xì)胞、原代細(xì)胞和組織在內(nèi)的樣品。
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為了解決以上問題，作者致力于發(fā)展一種低毒性、高效率、廣泛適用于各種樣品的RNA結(jié)合蛋白分析策略。作者首先設(shè)計了一個可以在特定條件下與蛋白和RNA發(fā)生反應(yīng)的雙功能探針，其一端是氨基，另外一端是一個呋喃基團(tuán)。同時作者使用曙紅作為光催化劑，可以在藍(lán)光照射下產(chǎn)生活性氧。在活性氧的作用下，含有富電子側(cè)鏈的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、組氨酸）被激活之后可以與氨基反應(yīng)，探針另外一端的呋喃環(huán)會轉(zhuǎn)化成1,4-烯二酮中間體進(jìn)而與胞嘧啶反應(yīng)，通過這種方式可以實現(xiàn)RNA與蛋白之間的連接。作者在小分子層面對兩個基團(tuán)的反應(yīng)性進(jìn)行了測試，發(fā)現(xiàn)它們分別可以與酪氨酸和胞嘧啶有效地反應(yīng)，且受到細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)（如GSH）的影響較小，因此作者認(rèn)為該方法具有較好的標(biāo)記效率和生物相容性。同時作者發(fā)現(xiàn)探針上的呋喃基團(tuán)只能和RNA反應(yīng)而不能和雙鏈DNA反應(yīng)，猜測可能是雙鏈結(jié)構(gòu)阻止了反應(yīng)的進(jìn)行，這也保證了本方法對于RNA結(jié)合蛋白的特異性。作者使用建立的方法對HK293T細(xì)胞中的RNA結(jié)合蛋白進(jìn)行分析，與之前報道的方法相比，作者發(fā)展的新方法能夠鑒定到更多的RNA結(jié)合蛋白。將鑒定到的RNA結(jié)合蛋白進(jìn)行功能分析，大量的蛋白富集于RNA相關(guān)的通路，證明了方法的有效性。隨后作者結(jié)合定量質(zhì)譜技術(shù)監(jiān)測了巨噬細(xì)胞在脂多糖（LPS）刺激條件下RNA-蛋白質(zhì)相互作用的變化，并將該方法用于SARS-COV2 5’-UTR相互作用蛋白的鑒定，為疾病的治療提供了新的線索。
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總的來說，作者通過設(shè)計與RNA和蛋白質(zhì)反應(yīng)的雙功能探針，與之前報道的方法相比，該方法具有較高的標(biāo)記效率、生物相容性和普適性，可適用于組織樣品的分析。同時，作者可以使用不同程度的激活條件實現(xiàn)時空分辨的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)組分析。但是作者也指出：活性氧的誘導(dǎo)會對細(xì)胞產(chǎn)生不可避免的傷害，因此作者在后續(xù)的研究中希望可以發(fā)展生物相容性更高或者反應(yīng)更迅速的RNA-蛋白交聯(lián)方法。
本文轉(zhuǎn)自“王初課題組”公眾號。
原文作者：XWD
責(zé)任編輯：LDY
原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202202008
文章引用：DOI：10.1002/anie.202202008
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