上海交大馮雁團隊基于Argonaute基因編輯酶建立新冠及流感病毒快速檢測新技術(shù)
近日，上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院、微生物代謝國家重點實驗室馮雁團隊在分子診斷領(lǐng)域權(quán)威期刊《Biosensors and Bioelectronics》上發(fā)表題為“Argonaute-integrated isothermal amplification for rapid, portable and multiplex detection of SARS-CoV-2 and influenza viruses”的研究論文。該工作利用高溫菌Argonaute（Ago）基因編輯酶的級聯(lián)剪切機制，結(jié)合快速等溫擴增，建立了新型多重快速核酸檢測平臺技術(shù)—MULAN (Multiplex Argonaute-based Nucleic Acid Detection)，實現(xiàn)了新冠及流感病毒樣本的高靈敏度、高特異性、快速的便攜式檢測。上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院博士生葉星宇、中國食品藥品檢定研究院周海衛(wèi)研究員為該論文共同第一作者，馮雁教授、許四宏研究員、劉倩副研究員為共同通訊作者。研究工作由上海交通大學(xué)、中國食品藥品檢定研究院、浙江科技學(xué)院、人和未來生物科技有限公司、萬孚生物技術(shù)股份有限公司、上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院等合作完成。
核酸檢測在新冠等傳染性疾病診療中發(fā)揮著重要作用, 目前對高靈敏度、快速、居家檢測的需求尤為迫切，以解決專業(yè)人員短缺、檢測結(jié)果等候時間長和檢測可靠性低等問題。近年來，CRISPR為代表的基因編輯酶（Cas12/13）核酸檢測技術(shù)，解決了核酸檢測中的假陽性、可視化等問題，被譽為“下一代分子診斷技術(shù)”，然而該體系存在引導(dǎo)鏈RNA合成昂貴且易降解、多重檢測反應(yīng)體系復(fù)雜等諸多問題，限制了其臨床應(yīng)用。
馮雁教授團隊探索了高溫微生物Pyrococcus furiosus Argonaute 核酸酶（PfAgo）對DNA的催化作用，發(fā)現(xiàn)其次級剪切機制，以及對單堿基差異靶標序列精準識別的規(guī)律。該工作中，作者建立了Ago-環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification,?LAMP）偶聯(lián)的多重核酸檢測平臺技術(shù)。其原理是，首先65 oC對病毒核酸樣本進行快速等溫擴增，然后與高溫Ago剪切體系混合，巧妙利用剪切產(chǎn)物DNA介導(dǎo)熒光標記DNA分子的次級剪切，產(chǎn)生相關(guān)病毒的熒光報告信號（圖１）。研究表明Ago精準剪切作用有效地解決了LAMP非特異擴增造成的假陽性問題。以新冠病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒為檢測對象，通過設(shè)計3組不同的特異性短鏈guide DNA與探針，建立多重檢測體系,實現(xiàn)了單酶對多重病毒核酸產(chǎn)物的精準識別，臨床樣本陽性符合率達到100%。
圖1. MULAN技術(shù)多重檢測工作原理
研究人員還針對新冠病毒單堿基突變株設(shè)計了高效的分型檢測方法。以新冠病毒及其D614G突變株為對象，巧妙地在熒光報告基因上引入單點錯配，提高Ago的靶標精準識別能力，實現(xiàn)了區(qū)分野生型和突變毒株的分型診斷（圖2）。在野生型和突變株基因不同混合比例的樣本測試中，MULAN可檢出5%的突變頻率，即可區(qū)分20：1混合樣本中有一份的突變病毒，具有高度特異性。
圖2. MULAN技術(shù)檢測新冠及其單堿基突變株的示意圖
研究團隊開發(fā)并驗證了配套的便攜式核酸即時檢測的設(shè)備與耗材（圖3A），實現(xiàn)了擴增-剪切“一管式”反應(yīng)，避免了CRISPR兩步法檢測的開蓋步驟，有效控制了環(huán)境污染。整個反應(yīng)時間控制在45分鐘以內(nèi)，較RT-qPCR時間（約80分鐘）更短，最低可檢出320 拷貝/毫升。MULAN技術(shù)還可結(jié)合膠體金免疫層析和藍光激發(fā)熒光效應(yīng)，直接通過肉眼觀察判定檢測結(jié)果（圖3B）。
圖3. MULAN技術(shù)與便攜式檢測設(shè)備（A）、檢測試紙及藍光照射（B）結(jié)合
總之，MULAN檢測平臺技術(shù)為病原體多重核酸檢測領(lǐng)域提供了一種極具前景的解決方案。與現(xiàn)有的檢測技術(shù)相比，它具有快速、準確、經(jīng)濟的優(yōu)勢，尤其是多重檢測的簡便性和安全性優(yōu)于目前報道的先進的CRISPR技術(shù)；MULAN技術(shù)與恒溫檢測設(shè)備、檢測試紙及藍光照射等結(jié)合，降低了對昂貴儀器設(shè)備（qPCR儀等）的依賴，其便攜性為新冠等傳染性疾病的居家檢測和基層檢測等提供了新方案。研究成果不僅對傳染病防控產(chǎn)生積極影響，也可應(yīng)用于對其他重大疾病診斷。合作單位交弘生物科技（上海）有限公司承擔(dān)相應(yīng)技術(shù)轉(zhuǎn)化及產(chǎn)品開發(fā)。
本研究得到了國家自然科學(xué)基金面上項目（31770078）、科技部重點研發(fā)計劃（2020YFA0907700）、上海交通大學(xué)“交大之星”計劃醫(yī)工交叉研究基金（20X990010002）和浙江大學(xué)防治新型冠狀病毒肺炎應(yīng)急科研項目（2020XGZX022）的支持。
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論文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956566322002093?dgcid=coauthor
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團隊介紹：
馮雁教授團隊聚焦分子酶學(xué)和合成生物學(xué)研究。近年來針對疾病分子診療方面的酶學(xué)需求，探索了微生物Agonaute 核酸酶的催化特性與進化相關(guān)性，揭示了酶對單堿基差異靶標序列精準識別的規(guī)律，創(chuàng)建了具有自主產(chǎn)權(quán)的腫瘤核酸富集和檢測“A-Star”（Nucleic Acids Research, 2021,?49(13), e75）、病原微生物核酸檢測“RADAR”（Bioresources and Bioprocessing, 2021, 8, 46）等系列新技術(shù)，突破了對國外CRISPR酶檢測技術(shù)的依賴性，為保障人類健康、食品安全、動物檢疫等行業(yè)發(fā)展提供理論和技術(shù)支撐。
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