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2022年1月1日，清華大學(xué)藥學(xué)院錢鋒課題組在藥物遞送領(lǐng)域的知名期刊 《Theranostics》在線發(fā)表題為“巨胞飲葡聚糖協(xié)助藥物在KRAS突變胰腺癌中的靶向遞送”（Macropinocytic dextran facilitates KRAS-targeted delivery while reducing drug-induced tumor immunity depletion in pancreatic cancer）的科研論文。胰腺癌內(nèi)部復(fù)雜的微環(huán)境中包含了腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞等多種組分，設(shè)計合適的遞送系統(tǒng)，選擇性地將細(xì)胞毒性藥物傳遞給癌細(xì)胞，并限制其對腫瘤微環(huán)境中的抑癌良性細(xì)胞，如效應(yīng)淋巴細(xì)胞的附帶損傷，具有重要的價值。胰腺癌細(xì)胞具有致癌基因KRAS突變，可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生高水平的巨胞飲。受到癌細(xì)胞這種異常行為的啟發(fā)，作者試圖探索葡聚糖（Dextran，一種被認(rèn)為以巨胞飲依賴的方式內(nèi)吞的生物材料）的靶向潛力。首先研究了不同分子量葡聚糖的入胞偏好、機(jī)制和亞細(xì)胞分選。然后將雷公藤甲素(一種有效的細(xì)胞毒素Triptolide)作為葡聚糖偶聯(lián)的模型藥物分子。通過體外細(xì)胞研究和體內(nèi)腫瘤模型評估，研究了葡聚糖偶聯(lián)TP對KRAS基因的選擇性和胰腺癌的治療效果。
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70kDa的葡聚糖具有更好靶向KRAS的潛力
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在體外細(xì)胞實驗中，作者測定了巨胞飲抑制劑EIPA作用前后，4kDa, 70kDa, 150kDa等不同分子量的葡聚糖在兩個KRAS突變細(xì)胞(MIAPaCa-2和Panc-1)和兩個KRAS野生型細(xì)胞(BxPC-3和NIH3T3)的入胞效率。發(fā)現(xiàn)70kDa的葡聚糖在所有的測試細(xì)胞系中都表現(xiàn)出普遍的EIPA敏感性和巨胞飲的內(nèi)吞依賴性。相比之下，雖然4kDa和150kDa的葡聚糖可以通過大胞飲作用內(nèi)化到一些細(xì)胞中(4kDa的葡聚糖進(jìn)入BxPC-3細(xì)胞(圖1A)，150kDa的葡聚糖進(jìn)入NIH3T3細(xì)胞(圖1C))，但它們與70kDa葡聚糖的依賴水平不同。 ?
藥物與葡聚糖的偶聯(lián)增強(qiáng)了對KRAS突變癌細(xì)胞的給藥選擇性
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作者通過酯鍵的方式將小分子藥物TP與70kDa的Dextran進(jìn)行了偶聯(lián)（圖2 A和B），通過比較TP和DEX-TP對BxPC-3和BxPC-3 KRASG12V細(xì)胞的療效，發(fā)現(xiàn)DEX-TP對KRAS突變表現(xiàn)出更強(qiáng)的藥物療效(圖2C)，而TP沒有選擇性(圖2D)。
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由于內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)的動力學(xué)，葡聚糖的偶聯(lián)導(dǎo)致了藥物效價的降低，即藥物半抑制濃度的增加。作者設(shè)定了新的公式以定量評估DEX-TP內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)的效率，更高的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)的效率值表明更顯著的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)過程。在實驗中，KRAS突變型細(xì)胞與KRAS野生型細(xì)胞之間的DEX-TP細(xì)胞沉積效率存在高達(dá)3-10倍的明顯差距。對于KRAS突變型癌細(xì)胞，其DEX-TP沉積效率在5.9到7.3之間；然而，對于KRAS野生型細(xì)胞，這些值的范圍為0.2到2（圖2E）。
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作者進(jìn)一步研究了KRAS對DEX-TP體內(nèi)療效的影響。建立來自MIAPaCa-2、BxPC-3和BxPC-3 KRASG12V細(xì)胞的皮下異種移植模型，平行比較了DEX-TP和TP的抗腫瘤作用。在這些比較中，作者觀察到只有在KRAS突變的細(xì)胞來源的異種移植模型中，即MIAPaCa-2-(圖2F)和BxPC-3 KRASG12V(圖2H)的模型中，DEX-TP的腫瘤生長抑制率高于游離TP。然而，與之形成鮮明對比的是，在BxPC-3 的異種移植模型中并不存在這種差異，作者觀察到DEX-TP并沒有改善TP的治療效果(圖2G)。然而，一旦重新引入致癌的KRASG12V，治療差異再次出現(xiàn)(圖2H)。 DEX-TP有效抑制了原位胰腺腫瘤的進(jìn)展
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利用熒光素酶表達(dá)原位的MIAPaCa-2作者構(gòu)建了原位的胰腺癌模型，用以進(jìn)一步評估DEX-TP的治療效果，記錄腫瘤生長（生物發(fā)光監(jiān)測）和小鼠生存情況，同時比較dex-TP、游離TP和PDAC一線化療藥物GEM等治療方法(圖3A)。
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基于熒光圖像，給藥量0.3mg/kg和1.0mg/kg 的DEX-TP在整個實驗過程中都顯著抑制了腫瘤生長(圖3B和4C)。在第22天治療結(jié)束時，1.0mg/kg DEX-TP顯示出優(yōu)于GEM的抗腫瘤優(yōu)勢(圖3D)。而且在治療期間，沒有觀察到DEX-TP治療的安全性問題或體重下降。與之相對比，GEM和TP治療組，每一組均發(fā)生了與藥物相關(guān)的小鼠死亡。 ?
DEX-TP延長了KPC移植小鼠的存活時間，緩解了TP的免疫消耗
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作為藥物分子，雷公藤甲素的不良作用之一是對白細(xì)胞的抑制作用，TP作為一種免疫抑制因子，已在中藥中應(yīng)用于自身免疫性疾病的治療數(shù)百年。然而，癌癥治療正傾向于利用免疫系統(tǒng)來對抗腫瘤的進(jìn)展。由于葡聚糖被證明可以提高TP的癌細(xì)胞選擇性，作者想知道這些偶聯(lián)物是否會以一種更有利于免疫系統(tǒng)的方式表現(xiàn)出來。在實驗中作者采用免疫活性KPC異體移植小鼠模型來研究DEX-TP對腫瘤微環(huán)境的影響(圖4A)。KPC同種異體移植瘤具有一些臨床相關(guān)的病理特性，如明顯纖維化和多成分組成。葡聚糖偶聯(lián)藥物組治療后的總生存率高于游離藥物治療(圖4B)。
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此外，兩種治療對腫瘤免疫反應(yīng)有很大的不同，這從免疫細(xì)胞標(biāo)志物CD8、CD4、CD3和CD45等抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α等抗腫瘤效應(yīng)因子的表達(dá)水平升高可以看出。對于游離TP，觀察到明顯的免疫抑制表型，而對于DEX-TP，這種損傷明顯被逆轉(zhuǎn)（圖4 C和D）。 ?
挑戰(zhàn)與展望
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目前雖然通過比較不同分子量的葡聚糖，篩選出了70kDa的Dextran能夠更有效地靶向KRAS突變癌細(xì)胞進(jìn)行藥物遞送，但是這一結(jié)果缺乏在物理化學(xué)和分子生物學(xué)層面的理論研究支持。不同分子量的葡聚糖是由于何種原因，如分子半徑、側(cè)鏈分布、表面電荷、細(xì)胞表面作用蛋白等因素導(dǎo)致了在細(xì)胞內(nèi)吞過程中行為的差于尚且沒有研究清楚。
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為了更深入地研究導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)吞過程中載體地選擇性問題，之后通過利用更全面的研究手段，如透射電鏡和動態(tài)激光散射確定不同分子量葡聚糖的分子半徑，表面電荷。通過對細(xì)胞不同的內(nèi)吞方式進(jìn)行選擇性抑制，鑒別各種分子量的葡聚糖主要的入胞方式。在此基礎(chǔ)上更清晰地解釋在癌細(xì)胞內(nèi)吞過程中藥物大分子本身性質(zhì)所導(dǎo)致的生物學(xué)行為差異。

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