最新研究成果 | 清華大學藥學院錢鋒課題組在《Theranostics》發(fā)表主題為“利用巨胞飲針對KRAS突變的腫瘤進行藥物遞送”的綜述文章
時間：2022-02-11 20:02:02學院：藥學院學校：清華大學
2022年1月1日，清華大學藥學院錢鋒課題組在藥物遞送領域的知名期刊《Theranostics》在線發(fā)表題為《利用巨胞飲針對KRAS突變的腫瘤進行藥物遞送》（Exploiting macropinocytosis for drug delivery into KRAS mutant cancer）的綜述論文。KRAS 突變是最常見腫瘤相關基因突變之一，尤其高發(fā)于胰腺癌、肺癌和結直腸癌。長期以來，KRAS 突變一直被認為是不可成藥的靶點，除了針對G12C突變亞型的抑制劑成功開發(fā)外，直接靶向 KRAS 突變的進展仍然有限?？茖W家們嘗試利用KRAS 突變細胞異常的代謝行為進行選擇性的藥物遞送。巨胞飲作用是一種非選擇性的內吞途徑，在 KRAS 突變的腫瘤細胞中上調，并對細胞的營養(yǎng)獲取和存活增殖起著關鍵作用。研究者們觀察到多種藥物遞送系統(tǒng)可以被KRAS 突變的癌細胞通過巨胞飲作用內吞，利用巨胞飲作用將治療藥物遞送至 KRAS 突變腫瘤細胞正在成為一種新的藥物遞送探索。論文回顧了KRAS 突變誘導的巨胞飲作用的腫瘤生物學研究，總結了最近利用增強的巨胞飲對 KRAS 突變癌細胞進行選擇性藥物遞送的研究，并討論了這種遞送策略用于抗腫瘤治療的潛在機遇和挑戰(zhàn)。
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巨胞飲
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對細胞外物質的主動轉運是活細胞的基本活動之一，是完成信號轉導、營養(yǎng)吸收、抗原攝取等許多重要生物學功能所必需的。主要的內吞途徑包括巨胞飲作用（Macropinocytosis）、網(wǎng)格蛋白介導的內吞作用、小窩介導的內吞作用和網(wǎng)格蛋白/小窩非依賴的內吞作用，不同途徑具有不同的調節(jié)機制。其中，巨胞飲作用是細胞從外部環(huán)境中攝取液體和溶質的一種內吞途徑，它被認為是不依賴受體、依賴肌動蛋白的非選擇性內吞途徑。早在 1931 年，Warren Lewis 就從形態(tài)學上描述了這一過程：在生長因子刺激下，大鼠巨噬細胞中觀察到質膜的波浪狀片狀延伸，并演變成直徑大于 0.2 μm 的囊泡，Lewis 將這種活動命名為胞飲作用（后來更名為巨胞飲作用），在該途徑中產(chǎn)生的囊泡稱為巨胞飲體。巨胞飲作用對Na?/H? exchangers (NHE) 抑制劑敏感，其原理是在 NHE 被抑制后，H? 滯留在細胞內，導致細胞溶質 pH 值降低，繼而影響巨胞飲過程的關鍵蛋白Rac1 和 Cdc42 向質膜的募集和激活。因此，NHE 抑制劑阿米洛利及其類似物 5-（乙基-N-異丙基）阿米洛利 (EIPA) 作為巨胞飲作用的特異性抑制劑廣泛用于鑒別巨胞飲作用。
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KRAS突變誘導的巨胞飲
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巨胞飲作用的特征之一是它可以受到生長因子（包括 EGF）的刺激。RAS 位于 EGFR 信號通路的下游，可以被生長因子刺激或致癌突變激活，從而刺激巨胞飲作用所必需的信號轉導通路，包括 Rac1、Cdc42 等。哺乳動物細胞中存在三種RAS 亞型：HRAS、KRAS 和 NRAS。Bar-Sagi 和 Feramisco 早在 1986 年就報道了致癌 HRAS 蛋白誘導的巨胞飲作用。KRAS突變的不同亞型與巨胞飲作用的關系均有研究， G12C、G12D、G12V亞型在不同的研究中顯示出誘導巨胞飲作用的能力，但 G12R 除外。NRAS 相關巨胞飲的研究則未見報道。
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巨胞飲作用是一種普遍的細胞過程，在 KRAS 突變的腫瘤細胞和正常細胞中都存在。因此，定量分析 KRAS 突變的腫瘤細胞和 KRAS 野生型的正常細胞的巨胞飲作用水平有助于理解這種“增強的巨胞飲作用”在多大程度上可以被用來提高藥物遞送的選擇性。迄今為止，大多數(shù)文獻報道了采用Commisso 等人報道的方法檢測巨胞飲水平，即將細胞或組織樣品在含有 1-2 mg/mL 熒光標記葡聚糖（一種巨胞飲的底物）的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng) 30 分鐘，然后使用熒光顯微鏡統(tǒng)計細胞中的平均熒光點數(shù)。盡管 KRAS 突變的腫瘤細胞巨胞飲作用升高已被不同實驗室反復驗證，但各項研究報道的巨胞飲水平絕對數(shù)值差異很大，目前對于KRAS 突變增強巨胞飲作用的程度仍難以定論。
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利用KRAS突變誘導的巨胞飲進行藥物遞送
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KRAS突變腫瘤細胞增強的巨胞飲這一生物學現(xiàn)象提示了一種潛在的藥物遞送策略：假設某個藥物遞送系統(tǒng)可以通過巨胞飲作用更多的被腫瘤細胞攝取，而更少的被正常細胞攝取，那么意味著這個藥物遞送系統(tǒng)可能存在一定的KRAS突變細胞選擇性，有望提高荷載藥物在KRAS突變細胞中的遞送效率。?
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白蛋白相關的藥物系統(tǒng)是研究最多的巨胞飲底物之一。人血清白蛋白（HSA）是人體內含量最豐富的血清蛋白， KRAS突變的胰腺癌細胞可以通過巨胞飲作用攝取胞外白蛋白并將其降解為氨基酸，作為重要的營養(yǎng)來源。有研究表明，將小分子藥物阿霉素與天然白蛋白共價偶聯(lián)，可以模擬白蛋白的內吞和細胞內轉運過程，從而利用增強的巨胞飲作用擴大細胞毒性藥物在KRAS 突變胰腺癌腫瘤模型中的治療窗口。Abraxane?是白蛋白結合型紫杉醇（nab-PTX），目前與吉西他濱聯(lián)合用作晚期胰腺癌的一線治療。有研究在肺癌的轉基因腫瘤模型中，通過EIPA 抑制實驗和 nab-PTX 與熒光葡聚糖的亞細胞共定位實驗驗證了KRASG12D 的腫瘤細胞對 nab-PTX 的巨胞飲攝取；該研究還發(fā)現(xiàn)，在KRAS野生型的腫瘤細胞中的誘導瞬時的 KRASG12D 過表達增強了 nab-PTX 的攝取。除了小分子外，白蛋白也被用于遞送蛋白質/肽類藥物，多項研究報道了白蛋白與治療性蛋白/肽的融合蛋白也可以通過巨胞飲的方式進入KRAS突變的腫瘤細胞。除了白蛋白相關的藥物遞送系統(tǒng)外，研究者們還報道了不同的藥物遞送載體，可以被 KRAS 突變的腫瘤細胞通過巨胞飲作用內吞，包括脂質、高分子聚合物、外泌體和無機納米顆粒等，如圖1。
圖1 通過巨胞飲機制被KRAS突變細胞內吞的藥物遞送系統(tǒng)
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挑戰(zhàn)與展望
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多項獨立研究表明，KRAS 突變的腫瘤細胞具有增強的巨胞飲作用，這些細胞通過巨胞飲作用內吞胞外蛋白質并將其降解為氨基酸，為腫瘤細胞的生物合成提供營養(yǎng)來源。除了胞外蛋白，許多藥物遞送載體也可以通過巨胞飲作用進入 KRAS 突變的腫瘤細胞，這些發(fā)現(xiàn)鼓勵研究者們嘗試利用巨胞飲作用將藥物選擇性地輸送到KRAS 突變的腫瘤細胞中。要將這種藥物遞送策略往臨床應用推進，仍然面臨一些未知和挑戰(zhàn)：①人們對巨胞飲過程在分子層面的認識仍然有限。目前用于鑒定一個藥物遞送載體是否通過巨胞飲機制內吞，僅有的手段是使用EIPA抑制劑，這種方法的特異性和準確性不足。因此，非常需要開發(fā)高度特異的化學和遺傳干擾工具用于識別巨胞飲作用；而這依賴于巨胞飲過程在分子層面的研究。②缺乏實時、定量的體內巨胞飲水平檢測方法。腫瘤患者是高度異質性的，并非所有患者都能受益于這種藥物遞送策略，如何準確方便的檢測每位患者腫瘤細胞的巨胞飲水平可能是轉化醫(yī)學研究的需要解決的技術障礙。③除了KRAS突變的腫瘤細胞外，一些特殊的細胞類型如巨噬細胞和樹突狀細胞，也存在活躍的巨胞飲，這表明基于巨胞飲的藥物遞送策略可能存在脫靶效應風險。思考這些挑戰(zhàn)，并通過精心設計的研究尋求解決方案將真正幫助我們了解巨胞飲，從而指導藥物遞送系統(tǒng)的合理設計，為這種藥物遞送策略未來的臨床應用鋪平道路。
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對細胞外物質的主動轉運是活細胞的基本活動之一，是完成信號轉導、營養(yǎng)吸收、抗原攝取等許多重要生物學功能所必需的。主要的內吞途徑包括巨胞飲作用（Macropinocytosis）、網(wǎng)格蛋白介導的內吞作用、小窩介導的內吞作用和網(wǎng)格蛋白/小窩非依賴的內吞作用，不同途徑具有不同的調節(jié)機制。其中，巨胞飲作用是細胞從外部環(huán)境中攝取液體和溶質的一種內吞途徑，它被認為是不依賴受體、依賴肌動蛋白的非選擇性內吞途徑。早在 1931 年，Warren Lewis 就從形態(tài)學上描述了這一過程：在生長因子刺激下，大鼠巨噬細胞中觀察到質膜的波浪狀片狀延伸，并演變成直徑大于 0.2 μm 的囊泡，Lewis 將這種活動命名為胞飲作用（后來更名為巨胞飲作用），在該途徑中產(chǎn)生的囊泡稱為巨胞飲體。巨胞飲作用對Na?/H? exchangers (NHE) 抑制劑敏感，其原理是在 NHE 被抑制后，H? 滯留在細胞內，導致細胞溶質 pH 值降低，繼而影響巨胞飲過程的關鍵蛋白Rac1 和 Cdc42 向質膜的募集和激活。因此，NHE 抑制劑阿米洛利及其類似物 5-（乙基-N-異丙基）阿米洛利 (EIPA) 作為巨胞飲作用的特異性抑制劑廣泛用于鑒別巨胞飲作用。
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KRAS突變誘導的巨胞飲
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巨胞飲作用的特征之一是它可以受到生長因子（包括 EGF）的刺激。RAS 位于 EGFR 信號通路的下游，可以被生長因子刺激或致癌突變激活，從而刺激巨胞飲作用所必需的信號轉導通路，包括 Rac1、Cdc42 等。哺乳動物細胞中存在三種RAS 亞型：HRAS、KRAS 和 NRAS。Bar-Sagi 和 Feramisco 早在 1986 年就報道了致癌 HRAS 蛋白誘導的巨胞飲作用。KRAS突變的不同亞型與巨胞飲作用的關系均有研究， G12C、G12D、G12V亞型在不同的研究中顯示出誘導巨胞飲作用的能力，但 G12R 除外。NRAS 相關巨胞飲的研究則未見報道。
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巨胞飲作用是一種普遍的細胞過程，在 KRAS 突變的腫瘤細胞和正常細胞中都存在。因此，定量分析 KRAS 突變的腫瘤細胞和 KRAS 野生型的正常細胞的巨胞飲作用水平有助于理解這種“增強的巨胞飲作用”在多大程度上可以被用來提高藥物遞送的選擇性。迄今為止，大多數(shù)文獻報道了采用Commisso 等人報道的方法檢測巨胞飲水平，即將細胞或組織樣品在含有 1-2 mg/mL 熒光標記葡聚糖（一種巨胞飲的底物）的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng) 30 分鐘，然后使用熒光顯微鏡統(tǒng)計細胞中的平均熒光點數(shù)。盡管 KRAS 突變的腫瘤細胞巨胞飲作用升高已被不同實驗室反復驗證，但各項研究報道的巨胞飲水平絕對數(shù)值差異很大，目前對于KRAS 突變增強巨胞飲作用的程度仍難以定論。
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利用KRAS突變誘導的巨胞飲進行藥物遞送
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KRAS突變腫瘤細胞增強的巨胞飲這一生物學現(xiàn)象提示了一種潛在的藥物遞送策略：假設某個藥物遞送系統(tǒng)可以通過巨胞飲作用更多的被腫瘤細胞攝取，而更少的被正常細胞攝取，那么意味著這個藥物遞送系統(tǒng)可能存在一定的KRAS突變細胞選擇性，有望提高荷載藥物在KRAS突變細胞中的遞送效率。?
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白蛋白相關的藥物系統(tǒng)是研究最多的巨胞飲底物之一。人血清白蛋白（HSA）是人體內含量最豐富的血清蛋白， KRAS突變的胰腺癌細胞可以通過巨胞飲作用攝取胞外白蛋白并將其降解為氨基酸，作為重要的營養(yǎng)來源。有研究表明，將小分子藥物阿霉素與天然白蛋白共價偶聯(lián)，可以模擬白蛋白的內吞和細胞內轉運過程，從而利用增強的巨胞飲作用擴大細胞毒性藥物在KRAS 突變胰腺癌腫瘤模型中的治療窗口。Abraxane?是白蛋白結合型紫杉醇（nab-PTX），目前與吉西他濱聯(lián)合用作晚期胰腺癌的一線治療。有研究在肺癌的轉基因腫瘤模型中，通過EIPA 抑制實驗和 nab-PTX 與熒光葡聚糖的亞細胞共定位實驗驗證了KRASG12D 的腫瘤細胞對 nab-PTX 的巨胞飲攝取；該研究還發(fā)現(xiàn)，在KRAS野生型的腫瘤細胞中的誘導瞬時的 KRASG12D 過表達增強了 nab-PTX 的攝取。除了小分子外，白蛋白也被用于遞送蛋白質/肽類藥物，多項研究報道了白蛋白與治療性蛋白/肽的融合蛋白也可以通過巨胞飲的方式進入KRAS突變的腫瘤細胞。除了白蛋白相關的藥物遞送系統(tǒng)外，研究者們還報道了不同的藥物遞送載體，可以被 KRAS 突變的腫瘤細胞通過巨胞飲作用內吞，包括脂質、高分子聚合物、外泌體和無機納米顆粒等，如圖1。
圖1 通過巨胞飲機制被KRAS突變細胞內吞的藥物遞送系統(tǒng)
挑戰(zhàn)與展望
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多項獨立研究表明，KRAS 突變的腫瘤細胞具有增強的巨胞飲作用，這些細胞通過巨胞飲作用內吞胞外蛋白質并將其降解為氨基酸，為腫瘤細胞的生物合成提供營養(yǎng)來源。除了胞外蛋白，許多藥物遞送載體也可以通過巨胞飲作用進入 KRAS 突變的腫瘤細胞，這些發(fā)現(xiàn)鼓勵研究者們嘗試利用巨胞飲作用將藥物選擇性地輸送到KRAS 突變的腫瘤細胞中。要將這種藥物遞送策略往臨床應用推進，仍然面臨一些未知和挑戰(zhàn)：①人們對巨胞飲過程在分子層面的認識仍然有限。目前用于鑒定一個藥物遞送載體是否通過巨胞飲機制內吞，僅有的手段是使用EIPA抑制劑，這種方法的特異性和準確性不足。因此，非常需要開發(fā)高度特異的化學和遺傳干擾工具用于識別巨胞飲作用；而這依賴于巨胞飲過程在分子層面的研究。②缺乏實時、定量的體內巨胞飲水平檢測方法。腫瘤患者是高度異質性的，并非所有患者都能受益于這種藥物遞送策略，如何準確方便的檢測每位患者腫瘤細胞的巨胞飲水平可能是轉化醫(yī)學研究的需要解決的技術障礙。③除了KRAS突變的腫瘤細胞外，一些特殊的細胞類型如巨噬細胞和樹突狀細胞，也存在活躍的巨胞飲，這表明基于巨胞飲的藥物遞送策略可能存在脫靶效應風險。思考這些挑戰(zhàn)，并通過精心設計的研究尋求解決方案將真正幫助我們了解巨胞飲，從而指導藥物遞送系統(tǒng)的合理設計，為這種藥物遞送策略未來的臨床應用鋪平道路。
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