最新研究成果 | 清華大學(xué)藥學(xué)院王建偉團隊在造血干細胞功能調(diào)控研究方向取得新進展
時間：2022-02-11 20:02:02學(xué)院：藥學(xué)院學(xué)校：清華大學(xué)
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一、研究背景
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造血干細胞（hematopoietic stem cell, HSC）是血液系統(tǒng)的干細胞，能夠向下游分化為所有血液細胞并保持自我更新的能力。維護造血干細胞正常功能對于維持血液和免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)具有重要的作用。因此，更好地解析造血干細胞的調(diào)控機制具有重要的科學(xué)意義。
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隨著高通量測序以及 RNA m6A 轉(zhuǎn)錄組測序（MeRIP-Seq 和 miCLIP）的開發(fā)利用，RNA m6A 參與調(diào)控的生物進程也逐漸成為研究熱點。在血液系統(tǒng)中，雖然有一些研究發(fā)現(xiàn) RNA m6A 通過其甲基轉(zhuǎn)移酶 Mettl3 和 Mettl14 調(diào)控 HSC 的功能，但是其分子機制仍不是很清楚。
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二、YTHDF3調(diào)控造血干細胞重建能力分子機制的研究
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1.敲除Ythdf3導(dǎo)致HSC的重建能力顯著降低，而敲除Ythdf1不影響HSC的重建能力
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首先，研究者構(gòu)建了RNA m6A識別蛋白YTHDF1和YTHDF3敲除小鼠（圖1A-B），分選HSC并進行造血干細胞移植實驗（圖1C）。結(jié)果顯示，敲除Ythdf1不影響造血干細胞的重建能力（圖1D），而敲除Ythdf3導(dǎo)致造血干細胞的重建能力顯著降低（圖1E）。因此，本論文進一步探究敲除Ythdf3導(dǎo)致造血干細胞的重建能力降低的分子機制。
圖1 敲除Ythdf3導(dǎo)致HSC的重建能力降低
2.敲除Ythdf3導(dǎo)致CCND1蛋白表達降低，但不影響其mRNA的表達
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本研究首先對Ythdf3-/- HSCs進行RNA轉(zhuǎn)錄組測序，并進行信號通路和基因表達分析（圖2A）。結(jié)果顯示，敲除Ythdf3導(dǎo)致核糖體信號通路顯著下調(diào)并且核糖體信號通路相關(guān)基因表達顯著下調(diào)（圖2B-C）。核糖體是蛋白合成的場所，本研究進一步對造血干細胞和造血祖細胞（LSKs）蛋白合成情況進行檢測（圖2D）。結(jié)果顯示，敲除Ythdf3導(dǎo)致LSKs蛋白合成顯著下降（圖2E-F）。綜合文獻分析，本研究利用Western Blot實驗對調(diào)控造血干細胞功能相關(guān)基因進行蛋白表達檢查，結(jié)果顯示，敲除Ythdf3導(dǎo)致CCND1蛋白表達下降，但不影響其mRNA的表達水平（圖2G-H）。為進一步驗證該結(jié)果，研究者利用shRNA敲降Ythdf3，檢測CCND1的蛋白水平和mRNA水平表達情況。結(jié)果顯示，敲降Ythdf3導(dǎo)致CCND1蛋白水平表達下降，但不影響其mRNA的表達水平（圖2I-K）。在敲除Ythdf1的小鼠LSK細胞中， CCND1的蛋白表達無顯著差異（圖2L）。這說明敲除Ythdf3導(dǎo)致CCND1蛋白表達降低不依賴于YTHDF1的表達。
圖2? 敲除Ythdf3導(dǎo)致CCND1蛋白表達降低
3.YTHDF3通過靶作用于Ccnd1 mRNA m6A修飾位點并且招募翻譯相關(guān)蛋白PABPC1和eIF4G2促進其翻譯?
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為探究YTHDF3調(diào)控CCND1蛋白表達的分子機制，本研究利用生物信息學(xué)對Ccnd1的mRNA進行分析，發(fā)現(xiàn)其5’UTR潛在RNA m6A修飾位點。因此，本研究構(gòu)建了Ccnd1 mRNA報告基因載體（WT），以及其突變型報告基因載體（MUT）。然后進行實驗檢測，結(jié)果顯示，過表達YTHDF3促進報告基因活性顯著升高，并且RNA m6A修飾位點突變后報告基因活性顯著降低（圖3A-C）。此外，本研究利用Rip-qPCR實驗，進一步證實YTHDF3與Ccnd1 mRNA直接結(jié)合（圖3D）。以上結(jié)果揭示YTHDF3調(diào)控CCND1蛋白表達依賴于RNA m6A修飾。同時發(fā)現(xiàn)分別敲降PABPC1和eIF4G2均導(dǎo)致CCND1蛋白表達降低（圖3E-F）。Co-IP實驗表明YTHDF3與PABPC1和eIF4G2互作（圖3G-H）。綜合以上結(jié)果，本研究揭示YTHDF3通過靶作用于Ccnd1 mRNA m6A修飾位點并且招募翻譯相關(guān)蛋白PABPC1和eIF4G2促進其翻譯。那么CCND1是否調(diào)控造血干細胞的重建能力？
圖3? YTHDF3與PABPC1和eIF4G2互作，并且通過靶作用于Ccnd1 mRNA m6A修飾位點促進其翻譯
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為探究CCND1是否調(diào)控造血干細胞的重建能力，本研究篩選出兩條能顯著敲降CCND1蛋白表達的gRNAs，并與Cas9表達小鼠相結(jié)合，進行移植實驗。實驗結(jié)果顯示，敲降CCND1顯著降低造血干細胞的重建能力（圖4A-B）。同時，研究者也在Ythdf3敲除和敲降的造血干細胞中過表達CCND1，檢測其是否可以挽救由于缺失Ythdf3導(dǎo)致造血干細胞重建能力降低的表型。結(jié)果顯示，在缺失Ythdf3造血干細胞中過表達CCND1可以完全挽救由于缺失Ythdf3導(dǎo)致造血干細胞重建能力降低的表型（圖4C-F）。這表明YTHDF3通過調(diào)控CCND1的表達進而調(diào)控造血干細胞的重建能力。綜合以上研究，研究者發(fā)現(xiàn)YTHDF3通過依賴識別Ccnd1 mRNA 上m6A修飾位點來調(diào)控CCND1的蛋白表達，并且進一步調(diào)控造血干細胞的重建能力。那么Ccnd1 mRNA 上m6A修飾位點是否由RNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶 METTL3寫入的呢？
圖4 ?過表達CCND1完全挽救由于缺失Ythdf3導(dǎo)致重建能力降低的表型
5.METTL3通過促進Ccnd1 RNA m6A修飾調(diào)控CCND1的翻譯
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為進一步探究Ccnd1 mRNA 上m6A修飾位點是否由RNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶 METTL3寫入的，本研究進行甲基化RNA免疫共沉淀實驗，結(jié)果顯示敲降METTL3顯著降低m6A抗體對Ccnd1 mRNA的富集能力（圖5A-B）。其結(jié)果揭示METTL3的表達促進Ccnd1 mRNA m6A修飾的發(fā)生。同時，本研究在小鼠LSK中發(fā)現(xiàn)，敲除Mettl3導(dǎo)致CCND1蛋白表達降低，但不影響其mRNA水平的表達（圖5C-D）。同時，研究者利用報告基因?qū)嶒灪蚏ip-qPCR實驗證實METTL3通過依賴于RNA m6A的方式調(diào)控CCND1的表達（圖5E-G）。
圖5? METTL3通過促進Ccnd1 RNA m6A修飾調(diào)控CCND1的翻譯
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為進一步探究缺失Mettl3對造血干細胞重建能力的影響。本研究分別進行Mettl3敲除和敲降造血干細胞移植實驗（圖6A和6C-D）。結(jié)果顯示，敲除和敲降Mettl3均導(dǎo)致造血干細胞的重建能力顯著降低（圖6B和6E）。但是，敲除Mettl3導(dǎo)致造血干細胞完全不能重建血液系統(tǒng)（圖6B），而敲降Mettl3的造血干細胞重建能力顯著降低，但仍具有一定重建血液系統(tǒng)的能力（圖6E），原因可能是敲降Mettl3后，造血干細胞中還保留一定Mettl3蛋白表達。此結(jié)果揭示METTL3是維持造血干細胞干性的必須基因。那么過表達CCND1是否可以挽救由于缺失Mettl3導(dǎo)致造血干細胞重建能力降低的表型？在敲除Mettl3的造血干細胞中，由于造血干細胞干性的丟失，過表達CCND1并不能挽救由于敲除Mettl3導(dǎo)致造血干細胞重建能力降低的表型。在敲降Mettl3的造血干細胞中過表達CCND1，可以部分挽救由于敲降Mettl3導(dǎo)致造血干細胞重建能力降低的表型（圖6F-G）。
圖6 缺失Mettl3導(dǎo)致HSC重建能力顯著降低，過表達CCND1部分挽救由于缺失Mettl3導(dǎo)致HSC重建能力降低的表型
三、總結(jié)
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綜上所述，本研究首次闡明了造血干細胞重建功能的信號通路之一為：METTL3→ RNA m6A→ YTHDF3 →CCND1（圖7）。同時本研究也為探索 RNA m6A 等 RNA 修飾調(diào)控造血干細胞等體細胞干細胞的功能機制提供了重要參考。
圖7? METTL3→ RNA m6A→ YTHDF3 →CCND1信號通路調(diào)控HSC重建功能模式圖
王建偉實驗室2017級博士生張瀟飛和2019級博士生叢婷婷為該論文的共同第一作者，王建偉研究員，浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院的姜虹博士和北京解放軍總醫(yī)院朱平主任為共同通訊作者。此外，多家單位的多位老師和學(xué)生也給與了很多幫助，在此一并表示感謝。本項目受到了國家自然科學(xué)基金（81870118, 91849106，61773230, 61721003）、國家重點研發(fā)計劃（2017YFA0104000，2018YFA0800200）、北京市科委項目（Z200022, Z181100001818005，2020YFA0906900，2020YFC2008900）及清華大學(xué)-北京大學(xué)生命科學(xué)聯(lián)合中心（Tsinghua-Peking Center for Life Sciences）的資助。
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參考文獻：
Xiaofei Zhang, Tingting Cong, Lei Wei, Bixi Zhong, Xiaowo Wang, Jin Sun, Shuxia Wang, Meng Michelle Xu, Ping Zhu, Hong Jiang, Jianwei Wang. YTHDF3 modulates hematopoietic stem cells by recognizing RNA m6A modification on Ccnd1. Haematologica.
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