結(jié)構(gòu)重排驅(qū)動(dòng)生物合成——上海交大鄧子新團(tuán)隊(duì)揭示二聚化非核糖體肽合成酶的催化循環(huán)軌跡
近日，上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院、微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄧子新教授團(tuán)隊(duì)于《自然通訊》（Nature Communications）雜志上發(fā)表題為 “表異構(gòu)酶嵌入式二聚化非核糖體肽合成酶的催化軌跡”（Catalytic trajectory of a dimeric nonribosomal peptide synthetase subunit with an inserted epimerase domain）的研究論文。該工作通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)與生物化學(xué)相結(jié)合的手段，解析致病因子合成機(jī)器多個(gè)催化狀態(tài)的三維結(jié)構(gòu)，捕獲其連續(xù)催化循環(huán)軌跡，深入推動(dòng)次生代謝巨型合酶的結(jié)構(gòu)研究，為理解二聚化非核糖體肽合成酶的催化機(jī)理、衍生新型靶點(diǎn)抑制劑藥物提供蛋白結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。上海交通大學(xué)博士后王嘉良與碩士生李丹丹為該論文共同第一作者，鄧子新教授、梁晶丹副研究員和汪志軍副研究員為共同通訊作者。
非核糖體肽合成酶（NRPSs）是一類多結(jié)構(gòu)域、模塊式巨型合酶，能夠合成具有廣泛生物活性的天然產(chǎn)物，從臨床用藥（抗生素、抗腫瘤抑制劑以及免疫抑制劑等）到致病因子（致癌分子、鐵載體等）。NRPSs以“裝配線”的方式進(jìn)行催化，其中的延伸模塊催化以下步驟：底物激活、中間產(chǎn)物穿梭以及縮合反應(yīng)；有時(shí)，還可催化修飾性的表異構(gòu)化反應(yīng)。
然而，高分辨NRPSs延伸模塊結(jié)構(gòu)信息的缺乏，障礙了人們進(jìn)一步理解該類巨型合酶的催化機(jī)制。例如，NRPSs中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域、氨基酸如何進(jìn)行底物的識(shí)別、激活與延伸？修飾性結(jié)構(gòu)域嵌入全酶的組織構(gòu)架怎樣？完整的巨型合酶如何通過關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)域的移動(dòng)進(jìn)行終產(chǎn)物的合成？自身各個(gè)結(jié)構(gòu)域間如何動(dòng)態(tài)協(xié)調(diào)完成催化循環(huán)？
針對上述關(guān)鍵性問題，鄧子新教授團(tuán)隊(duì)通過冷凍電子顯微鏡單顆粒分析技術(shù)，成功解析2.97 ?、3.78 ?和3.47??的一個(gè)典型NRPS延伸模塊PchE的三個(gè)高分辨構(gòu)象（圖1）。該巨型合酶負(fù)責(zé)銅綠假單胞菌中致病因子Pyochelin的生物合成，包含五個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，分別為：芳香基載體蛋白（ArCP）、縮合環(huán)化結(jié)構(gòu)域（Cy）、腺苷化結(jié)構(gòu)域（A）、表異構(gòu)酶（E）以及肽基載體蛋白（PCP）。作為罕見的二聚化NRPS，PchE呈現(xiàn)一種特殊的頭對尾、“H” 形構(gòu)架。二聚化界面完全由兩個(gè)單體中Cy-A結(jié)構(gòu)域的反向相互作用介導(dǎo)，互作面積達(dá)到2337 ?2。
圖1.PchE三個(gè)構(gòu)象的構(gòu)架
PchE的三個(gè)構(gòu)象對應(yīng)了三種不同的催化狀態(tài)：底物供給、縮合以及縮合后構(gòu)象。三者的分別捕獲明確了Cy結(jié)構(gòu)域與兩個(gè)載體蛋白的結(jié)合模式；建立了底物、終產(chǎn)物與底物通道、活性位點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系（圖2）。在結(jié)構(gòu)信息指導(dǎo)下，通過對關(guān)鍵活性位點(diǎn)氨基酸的點(diǎn)突變與生化檢測，闡明其環(huán)化縮合過程中關(guān)鍵氨基酸對線性中間產(chǎn)物生成的影響以及環(huán)化終產(chǎn)物合成的原理。在催化過程中，Cy結(jié)構(gòu)域中氨基酸F372的旋轉(zhuǎn)起到開關(guān)控制作用（視頻1）。當(dāng)其芳香環(huán)側(cè)鏈朝向外側(cè)時(shí)，ArCP能夠與Cy結(jié)構(gòu)域結(jié)合，通過磷酸泛?；瘞€基乙胺手臂供給小分子水楊酸底物；反之當(dāng)芳香環(huán)側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)至內(nèi)側(cè)時(shí)，底物通道被截?cái)?，ArCP無法供給底物。
圖2.Cy結(jié)構(gòu)域的底物供給、縮合及縮合后催化狀態(tài)
視頻1.F372控制Cy結(jié)構(gòu)域底物通道的開放與關(guān)閉
利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)深度學(xué)習(xí)的手段，研究人員進(jìn)一步觀察到PchE完整催化循環(huán)的連續(xù)動(dòng)態(tài)軌跡，從底物激活直至表異構(gòu)化反應(yīng)（圖3，視頻2）。催化反應(yīng)起始于構(gòu)象（i），ArCP結(jié)合在Cy結(jié)構(gòu)域上，代表底物供給構(gòu)象。（ii）隨后PCP移動(dòng)至處于硫酯形成構(gòu)象的A結(jié)構(gòu)域，加載被激活的底物L(fēng)型半胱氨酸。（iii）此時(shí)，A羧基末端亞結(jié)構(gòu)域，連帶鑲嵌式E結(jié)構(gòu)域發(fā)生約155° 的大尺度旋轉(zhuǎn)，從硫酯形成構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)橄佘招纬蓸?gòu)象，準(zhǔn)備加載、激活下一分子半胱氨酸。（iv）接近著，PCP與ArCP同時(shí)結(jié)合在Cy結(jié)構(gòu)域的兩側(cè)并分別供給底物水楊酸與半胱氨酸，Cy結(jié)構(gòu)域催化兩個(gè)底物分子的縮合、環(huán)化。（ⅴ）隨后ArCP結(jié)構(gòu)域離開Cy，推測其與上游激活模塊相互作用并加載新一個(gè)水楊酸底物分子。（ⅵ）最終，A羧基末端亞結(jié)構(gòu)域重新旋轉(zhuǎn)回來，再次呈現(xiàn)硫酯形成構(gòu)象；PCP攜帶縮合環(huán)化后的中間產(chǎn)物移動(dòng)至E結(jié)構(gòu)域，后者將二氫噻唑環(huán)部分的立體異構(gòu)從L型轉(zhuǎn)換為D型。在將中間產(chǎn)物傳遞至下游蛋白模塊后，PCP重新恢復(fù)（i）的位置，準(zhǔn)備開啟下一輪的催化循環(huán)。
圖3.PchE的催化循環(huán)軌跡
視頻2.PchE催化軌跡的連續(xù)動(dòng)態(tài)過程
綜上所述，典型的NRPS延伸模塊PchE，通過整合多個(gè)維度下的結(jié)構(gòu)重排，驅(qū)動(dòng)終產(chǎn)物的合成，猶如一場精心設(shè)計(jì)的生物大分子舞蹈。結(jié)構(gòu)域的大尺度移動(dòng)造就不同的催化狀態(tài)，底物通道的開關(guān)控制小分子化合物的進(jìn)入與否，關(guān)鍵氨基酸的位置協(xié)調(diào)催化反應(yīng)的進(jìn)行。該結(jié)構(gòu)的解析建立了模塊內(nèi)、結(jié)構(gòu)域間催化軌跡的基本框架，為工程化改造修飾性結(jié)構(gòu)域嵌入式的二聚化NRPSs，合成創(chuàng)新藥物提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
英國劍橋大學(xué)醫(yī)學(xué)研究所（CIMR）?Tristan Croll副研究員、上海交大博士生曹衛(wèi)、碩士生陳璐、生科院儀器平臺(tái)張薇老師、國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（上海）孔亮亮老師參與了該項(xiàng)工作。
感謝國家蛋白質(zhì)中心王芳芳、辛立輝、李光一、段佳琳、劉娜等老師的技術(shù)支持。感謝上海交通大學(xué)超算中心π 2.0集群以及孫錦文老師提供的平臺(tái)及技術(shù)支持。?感謝中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心尤琳琳博士以及麻省理工學(xué)院（MIT）Ellen D. Zhong博士的幫助。
該研究得到了國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃合成生物學(xué)專項(xiàng)（2018YFA0900700、2019YFA0905400、2021YFA0910500）、國家自然科學(xué)基金（32171252、91753123、31470830）、上海超級(jí)博士后激勵(lì)計(jì)劃（202112）以及Wellcome Trust（209407/Z/17/Z）的經(jīng)費(fèi)支持。
文章鏈接： https://www.nature.com/articles/s41467-022-28284-x
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