Neuron | 陳雷研究組報(bào)道胞內(nèi)鈣離子對TRPC3/6通道調(diào)控的機(jī)制
經(jīng)典型瞬時(shí)受體電勢通道TRPC是一類通透鈣離子的非選擇性陽離子通道1，與最早在果蠅感光系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的TRP通道的序列相似性最高2,3，并且可以被第二信使DAG所激活。根據(jù)序列相似性以及通道的電生理特性，TRPC3/6/7形成了一個(gè)亞類4。TRPC3/6/7通道參與多種神經(jīng)活動，例如TRPC3在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高表達(dá)，參與神經(jīng)生長因子BDNF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)5，同時(shí)TRPC3還與神經(jīng)突觸信號傳遞以及運(yùn)動協(xié)調(diào)有關(guān)6,7。TRPC6通道可以促進(jìn)神經(jīng)元存活以及興奮性突觸的形成等8,9。除此之外，TRPC3/6/7通道也參與肌源性血管收縮，血壓調(diào)節(jié)等過程，并且和多種疾病的發(fā)生有關(guān)，比如病理性心肌肥大，癌癥發(fā)生，糖尿病等10。其中人源TRPC6基因功能獲得性突變（GOF）會引發(fā)局灶節(jié)段性腎小球硬化癥（FSGS）11,12。因此，TRPC6通道的抑制劑有望用于治療該類疾病。2007年有低分辨率冷凍電鏡研究表明TRPC3的胞質(zhì)區(qū)可能存在一個(gè)空腔13，但由于分辨率所限，以及重構(gòu)所得電子密度存在較多噪音，該空腔的具體結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)并不清楚。2017年陳雷課題組和呂偉-杜鵑課題組分別獨(dú)立報(bào)道了TRPC6和TRPC3的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)14,15，這些結(jié)構(gòu)展示了該通道的整體架構(gòu)，并顯示在TRPC3/6通道中的確存在一個(gè)“胞質(zhì)內(nèi)空腔”。隨后，Amgen公司報(bào)道了TRPC6通道與抑制劑及激活劑的復(fù)合物結(jié)構(gòu)16。盡管如此，該領(lǐng)域仍然存在著重要的科學(xué)問題尚待解決。比如，此前研究表明Ca2+可以調(diào)控TRPC3/6/7通道的活性17-22，但其調(diào)控機(jī)制以及FSGS相關(guān)突變體的致病機(jī)制仍不清楚。
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2022年1月19日，生命科學(xué)聯(lián)合中心、北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究所陳雷研究組在Neuron雜志上報(bào)導(dǎo)了Ca2+對人源TRPC3/6調(diào)控的結(jié)構(gòu)機(jī)制以及FSGS相關(guān)突變體的致病機(jī)制。
在對TRPC3/6通道研究的過程中，作者們使用內(nèi)面向外式膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)側(cè)Ca2+可以抑制TRPC3通道本底電流，而對TRPC6通道本底電流展現(xiàn)出低濃度激活高濃度抑制的現(xiàn)象。隨后他們發(fā)現(xiàn)Ca2+可以提高純化的TRPC3/6蛋白樣品的熱穩(wěn)定性，確定了Ca2+可以與TRPC3/6蛋白直接結(jié)合。為了明確Ca2+調(diào)控TRPC3/6的結(jié)構(gòu)機(jī)制，作者們解析了TRPC3/6通道的一系列高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。通過結(jié)構(gòu)比較，作者們在TRPC3/6中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)（CBS1-3）。隨后的點(diǎn)突變、電生理和熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CBS1為Ca2+抑制性位點(diǎn)，CBS3為Ca2+激活性位點(diǎn)。Ca2+在抑制性CBS1的結(jié)合導(dǎo)致TRPC3/6通道胞內(nèi)區(qū)的結(jié)構(gòu)更加緊湊，使陽離子無法從胞質(zhì)內(nèi)空腔中順利流出，從而使電流減弱。進(jìn)一步地，作者們使用全細(xì)胞記錄模式，發(fā)現(xiàn)Ca2+通過抑制性CBS1和激活性CBS3對DAG激活的TRPC3/6電流同樣產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。
結(jié)構(gòu)顯示在FSGS疾病中發(fā)現(xiàn)的TRPC6 GOF點(diǎn)突變都分布于胞內(nèi)區(qū)亞基間相互作用的界面上，有可能破壞了亞基間的相互作用。為了驗(yàn)證此假說，作者們解析了GOF突變體的結(jié)構(gòu)，并通過電生理和熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GOF突變體減弱了抑制性Ca2+結(jié)合位點(diǎn)（CBS1）的作用，使胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)變得松散，從而打開了陽離子從胞質(zhì)內(nèi)空腔向胞質(zhì)區(qū)流出的孔道。
最后作者們解析了BTDM以及SAR7334與TRPC6結(jié)合的高分辨率結(jié)構(gòu)（2.9 ?），明確了這些抑制劑與TRPC6結(jié)合的模式。
綜上所述，本項(xiàng)研究通過結(jié)構(gòu)解析以及功能驗(yàn)證，確定TRPC3/6通道在胞質(zhì)區(qū)有一個(gè)抑制性Ca2+結(jié)合位點(diǎn)CBS1。當(dāng)Ca2+濃度較高時(shí)，該位點(diǎn)會結(jié)合Ca2+，促進(jìn)多個(gè)胞質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)域之間的緊密堆積，從而抑制陽離子從TRPC通道胞質(zhì)內(nèi)空腔向細(xì)胞質(zhì)的流動。當(dāng)Ca2+濃度較低時(shí)，Ca2+從該位點(diǎn)解離，使胞質(zhì)區(qū)呈現(xiàn)較為松散的結(jié)構(gòu)，從而打開了離子從胞質(zhì)內(nèi)空腔向胞質(zhì)區(qū)流動的通路。這個(gè)抑制位點(diǎn)提供了Ca2+對TRPC通道的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。TRPC通道在跨膜區(qū)還具有激活型Ca2+結(jié)合位點(diǎn)CBS3。抑制型和激活型Ca2+結(jié)合位點(diǎn)的作用相互疊加，導(dǎo)致了TRPC通道對胞內(nèi)鈣離子濃度復(fù)雜的響應(yīng)。而在FSGS患者中發(fā)現(xiàn)的TRPC6 GOF突變破壞了TRPC6胞質(zhì)區(qū)的抑制性CBS1的功能，但不影響激活型CBS3的功能，從而使突變體通道在有Ca2+流入的情況下發(fā)生正反饋而持續(xù)激活，腎臟足細(xì)胞Ca2+離子過載，最終引發(fā)FSGS疾病的發(fā)生（圖1）。此外，不同小分子抑制劑BTDM和SAR7334在TRPC6上的結(jié)合位點(diǎn)迥異，并且使TRPC6處于不同的關(guān)閉構(gòu)象，從而為基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)提供了理論支持。
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圖1 Ca2+通過CBS1-3對TRPC3/6及FSGS相關(guān)突變體的調(diào)控模式圖
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本項(xiàng)研究的第一作者為北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究所博士研究生郭文君；博士生湯晴麟、韋淼，博士后康云路和吳驚香參與了部分實(shí)驗(yàn)；陳雷研究員為通訊作者。本項(xiàng)研究中的小分子BTDM由迪哲醫(yī)藥有限公司張小林博士提供；北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所周專教授及其博士生李祎曼、北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王世強(qiáng)教授、北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王友軍教授以及北京航空航天大學(xué)楊亞雄博士在電生理實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析方面給予了指導(dǎo)和幫助。本工作獲得國家自然科學(xué)基金委、生命科學(xué)聯(lián)合中心等經(jīng)費(fèi)支持。該工作的冷凍電鏡樣品制備、篩選和采集在北京大學(xué)電鏡室和冷凍電鏡平臺上完成，得到了李雪梅、郭振璽、邵博、裴霞和王國鵬等人的幫助。該項(xiàng)目的部分?jǐn)?shù)據(jù)處理獲得了北京大學(xué)CLS計(jì)算平臺及未名超算平臺的硬件和技術(shù)支持。
陳雷實(shí)驗(yàn)室主要研究膜蛋白特別是與代謝類疾病和心血管疾病相關(guān)的重要膜蛋白的工作機(jī)制（http://www.imm.pku.edu.cn/kytd/rcdw/34142.htm）。陳雷實(shí)驗(yàn)室長期招聘博士后，希望有細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、電生理、抗體制備或結(jié)構(gòu)生物學(xué)背景的博士加入該實(shí)驗(yàn)室。
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