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紅樹林濕地微生物處于高鹽、高有機(jī)質(zhì)含量和潮水反復(fù)浸沒的特殊環(huán)境，具有獨特的微生物群系。紅樹林沉積物具有豐富的微生物和基因多樣性，特別是碳水化合物代謝、能量代謝和氨基酸代謝的相關(guān)基因，這也是新的微生物和基因資源的潛在儲藏庫。

廣西大學(xué)蔣承建教授領(lǐng)銜的“亞熱帶海洋紅樹林濕地微生物功能”研究團(tuán)隊，針對亞熱帶北部灣豐富的海洋紅樹林濕地微生物新資源，利用各類組學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了相應(yīng)的濕地微生物種質(zhì)資源庫。發(fā)現(xiàn)種質(zhì)資源庫中的Pichia guilliermondiiGXDK6可以分別利用五碳糖、六碳糖為唯一碳源產(chǎn)β-葡萄糖苷酶。進(jìn)一步揭示了GXDK6在酸堿（pH 2.5~10.0），鹽堿（0~12% NaCl，0~18% KCl/MgCl₂）和重金屬（Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺和Mn²⁺等）環(huán)境下顯示出高耐受性能。同時還發(fā)現(xiàn)GXDK6可以利用21種單一有機(jī)質(zhì)，并產(chǎn)生豐富的芳香類代謝產(chǎn)物。

為了進(jìn)一步研究GXDK6發(fā)酵產(chǎn)生香氣的分子機(jī)理，以橙花醇作為代表的新型芳香代謝物，與GXDK6的全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行了進(jìn)一步比較和分析，并進(jìn)一步闡明了其代謝途徑（圖1）。橙花醇（Nerol, C₁₀H₁₈O）作為有價值的香料，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中。目前化學(xué)合成是大規(guī)模生產(chǎn)橙花醇的唯一策略，但是化學(xué)合成的缺點極大地限制了橙花醇的生產(chǎn)和應(yīng)用，然而限制環(huán)保的生物合成法生產(chǎn)橙花醇的主要技術(shù)瓶頸是，缺乏相應(yīng)的天然產(chǎn)生香氣的微生物。橙花醇的來源首先是將糖酵解或檸檬酸循環(huán)的上游來源1-脫氧-d-木酮糖5-磷酸香葉基二磷酸或芳樟醇橙花醇轉(zhuǎn)化為最終的香葉酸或8-氧香葉醛。在此過程中，參與橙花醇合成的蛋白質(zhì)是香葉基二磷酸酶，單三苯基二磷酸酶和香葉醇異構(gòu)酶。涉及橙花醇代謝轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)是香葉醇8-羥化酶，醇脫氫酶和香葉醇脫氫酶。相關(guān)報道在大腸桿菌代謝工程菌中發(fā)酵葡萄糖合成橙花醇，積累量為0.053±0.015 mg /L。橙花醇是由tNDPS1基因催化二磷酸異戊烯基（IPP）和磷酸二甲基烯丙酯（DMAPP）形成了神經(jīng)磷酸二磷酸酯（NPP），然后將橙花醇合成酶基因GmNES共表達(dá)以從NPP合成最終產(chǎn)物橙花醇。然而，以葡萄糖為底物發(fā)酵時，GXDK6的橙花醇積累約為2.74 mg/L（p <0.05），高于通過大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的橙花醇，但橙花醇在天然Meyerozyma guilliermondii的生物合成機(jī)理尚未被報道。本研究研究表明具有多重耐受性的生香季也蒙畢赤酵母GXDK6在發(fā)酵工業(yè)中具有巨大的潛在價值（Microbial Cell Factories. 2021, 20: 4）。

圖1：M. guilliermondiiGXDK6生物合成橙花醇的機(jī)制闡述。

研究團(tuán)隊通過全基因組學(xué)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)，代謝組學(xué)整合分析揭示了GXDK6的銅耐受機(jī)制（圖2）。全基因組分析結(jié)果顯示，9個基因即（CCC2、CTR3、FRE2、GGT、GST、CAT、SOD2、PXMP4和HSP82）與GXDK6銅耐受性相關(guān)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果表明，在銅脅迫下，谷胱甘肽代謝相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，谷胱甘肽含量和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶活性提高，表明細(xì)胞中銅的結(jié)合和銅解毒能力增強。銅轉(zhuǎn)運蛋白Ctr3抑制銅吸收和Ccc2增強銅泵出細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)銅濃度降低?？寡趸富颍?em>PXMP4、SOD2和CAT）表達(dá)上調(diào)，抗氧化酶酶活性也隨之提高，降低了銅誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生、蛋白質(zhì)羰基化、膜脂過氧化和細(xì)胞死亡，從而提高細(xì)胞在銅脅迫下的生存率。代謝組學(xué)分析結(jié)果表明GXDK6在銅脅迫下，能積累大量D-甘露糖，外源添加D-甘露糖實驗驗證D-甘露糖有利于提高GXDK6銅耐受性。該研究有助于了解M. guilliermondii的銅耐受機(jī)制，及將其運用于食品發(fā)酵過程中去除銅奠定理論基礎(chǔ)（Frontiers in Microbiology. 2021.12: 771878）。

圖2：多組學(xué)整合分析揭示新型多重脅迫耐受海洋酵母Meyerozyma guilliermondiiGXDK6的銅耐受機(jī)制

研究團(tuán)隊采用多組學(xué)結(jié)合的方法系統(tǒng)揭示了高濃度NaCl脅迫下海洋季也蒙畢赤酵母GXDK6的脂質(zhì)代謝機(jī)制，并測試了GXDK6在脂質(zhì)代謝轉(zhuǎn)變時對抗生素的敏感性。全基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，與無鹽脅迫相比，當(dāng)GXDK6感知10% NaCl脅迫時，調(diào)控細(xì)胞出芽的AYR1顯著下調(diào)2.69倍，其調(diào)控的蛋白NADPH-dependent 1-acyldihydroxyacetone phosphate reductase顯著下調(diào)1.35倍，表明鹽脅迫下GXDK6的細(xì)胞增殖被削弱。10%NaCl脅迫下GXDK6的OD₆₀₀值下降了64.39%，也驗證了這一發(fā)現(xiàn)。同時，鹽脅迫促使DEGs（如GUT1、GPP1、TDA10）和DEPs（如glycerol kinase、aldehyde dehydrogenase）顯著富集在調(diào)控甘油代謝的通路（甘油磷脂代謝、甘油脂代謝），使甘油在胞內(nèi)大量積累，可知甘油貢獻(xiàn)于GXDK6的耐鹽生存。這與外源添加甘油探究其對鹽脅迫下GXDK6生長的驗證試驗結(jié)果一致。此外，我們發(fā)現(xiàn)鹽脅迫有助于增強氟康唑?qū)φ婢臍饔?。與不含鹽脅迫相比，GXDK6的菌落數(shù)在10% NaCl和64 μg/mL氟康唑條件下降低97.70%。表明氟康唑高度選擇性干擾真菌的細(xì)胞色素P-450的活性，抑制了真菌細(xì)胞膜上麥角固醇的生物合成，且感知鹽脅迫后，季也蒙畢赤酵母中調(diào)控麥角固醇合成的基因（ERG1、ERG5、ERG11、ERG24）和蛋白（如羊毛甾醇14-α脫甲基酶）也顯著下調(diào)表達(dá)，進(jìn)一步抑制了麥角固醇的合成，從而強化了氟康唑的殺滅作用。該研究為Meyerozyma guilliermondii在鹽脅迫下的脂質(zhì)代謝調(diào)控機(jī)制提供了新的見解，可為增強氟康唑?qū)φ婢臍缱饔锰峁┝诵峦緩剑?strong>Frontiers inGenetics. 2022. 12: 798535）。

圖3：多組學(xué)整合分析揭示新型多重脅迫耐受海洋酵母Meyerozyma guilliermondiiGXDK6的脂代謝作用機(jī)制

上述相關(guān)研究亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)利用國家重點實驗室、廣西微生物與酶工程技術(shù)研究中心和廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院為成果第一單位?？茖W(xué)研究得到了廣西科學(xué)院廣西紅樹林研究中心的直接支持和指導(dǎo)。研究成果得到了國家自然科學(xué)基金項目、國家科技部基礎(chǔ)自然調(diào)查專項調(diào)查項目、中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金項目和廣西杰出青年基金項目等的直接資助。