生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院楊立桃課題組開發(fā)適用于多種轉(zhuǎn)基因生物外源DNA整合分子特征完整解析的長片段富集測序新技術(shù)
近日，上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院張大兵團隊楊立桃課題組在植物學(xué)權(quán)威期刊《Plant Biotechnology Journal》在線發(fā)表了題為“LIFE-Seq: A universal Large Integrated DNA Fragment Enrichment Sequencing strategy for deciphering the transgene integration of genetically modified organisms”的研究論文，首次建立了一種適合于多種轉(zhuǎn)基因生物外源DNA整合位點、旁側(cè)序列等分子特征解析的大片段捕獲測序新技術(shù)。上海交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院博士研究生張瀚文為本文的第一作者，楊立桃教授為通訊作者。
轉(zhuǎn)基因生物(GMO)的分子特征主要包括外源DNA在受體基因組上的整合位點、完整插入序列和結(jié)構(gòu)、旁側(cè)序列和拷貝數(shù)等信息。分子特征解析是轉(zhuǎn)基因生物安全評價的核心內(nèi)容之一，每個轉(zhuǎn)基因生物品系必須提供準(zhǔn)確、完善的分子特征數(shù)據(jù)才可能被批準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用。因此，準(zhǔn)確識別和解析轉(zhuǎn)基因生物的分子特征對于我國轉(zhuǎn)基因生物的商業(yè)化應(yīng)用至關(guān)重要。但是，現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因技術(shù)都是通過隨機整合方式將外源DNA轉(zhuǎn)入受體物種的基因組上的，整合方式及機制尚不清晰，導(dǎo)致外源DNA整合的分子特征識別和解析非常困難。特別是，對具有復(fù)雜重排、倒位和串聯(lián)重復(fù)等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的大DNA片段整合的分析技術(shù)方法十分缺乏。為此，上海交通大學(xué)國家轉(zhuǎn)基因生物分子特征驗證測試中心開發(fā)了一種通用型的適合于多種轉(zhuǎn)基因生物的分子特征破譯策略LIFE-Seq。
該研究首先從團隊前期建立的轉(zhuǎn)基因生物檢測方法數(shù)據(jù)庫（GMDD）中，篩選主要常用的轉(zhuǎn)基因元件、外源基因、物種內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因等構(gòu)建序列數(shù)據(jù)集，設(shè)計了一套高覆蓋率的寡核苷酸探針庫，可以覆蓋99.1%的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物；然后利用液相雜交富集捕獲轉(zhuǎn)基因生物基因組中含有外源DNA序列的大片段；最后利用PacBio測序獲得捕獲的大片段DNA的具體序列信息，構(gòu)建了長片段序列分析算法，實現(xiàn)對外源DNA整合位點、方式、結(jié)構(gòu)和旁側(cè)序列的完整破譯。
圖1.LIFE-Seq 工作原理示意圖
實驗以6種轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻和油菜商業(yè)化應(yīng)用的轉(zhuǎn)化體為實驗材料，設(shè)計了不同轉(zhuǎn)基因含量的測試樣品以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諛悠?，系統(tǒng)測試了LIFE-Seq方法的可行性和準(zhǔn)確性。每個測試樣本生成約 26,352 個高保真 CCS reads，平均長度約 6275 bp，所獲得的CCS reads成功覆蓋了相應(yīng)的植物內(nèi)源參考基因，說明系統(tǒng)可以對目標(biāo)DNA片段有效富集。同時覆蓋植物參考基因組序列和轉(zhuǎn)基因外源DNA文庫的CCS reads被篩選出作為候選CCS reads進行完整的插入結(jié)構(gòu)解析。解析結(jié)果表明利用LIFE-Seq 成功破譯了5個轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體（NK603玉米、MON810玉米、TT51-1水稻、GTS40-3-2 大豆和 RT73油菜）的外源DNA整合等分子特征。在RF2轉(zhuǎn)化體含量只有1.0%的混合樣本中，也分析獲得了RF2轉(zhuǎn)化體的部分整合位點分子特征數(shù)。例如，在NK603玉米樣本中，直接獲得了含有完整的7462bp外源DNA整合結(jié)構(gòu)和插入位點旁側(cè)序列的CCS read，序列信息直接闡明了外源DNA插入到受體玉米基因組的Chr06 61665252處，有3bp的缺失。MON810玉米的結(jié)果顯示直接獲得了CCS reads含有完整的外源DNA全部整合結(jié)構(gòu)、插入位點旁側(cè)序列和受體基因組在整合位點附近的重排結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)基因NK603玉米和MON810玉米外源DNA的整個插入結(jié)構(gòu)見圖2所示。
圖2.轉(zhuǎn)基因玉米NK603（S1）和MON810（S2）中轉(zhuǎn)基因整合結(jié)構(gòu)示意圖
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研究結(jié)果表明，LIFE-Seq成功對多種轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)化體的外源DNA整合分子特征進行了清晰、準(zhǔn)確的解析。與Southern blot、Sanger測序、重測序等技術(shù)相比，外源DNA整合數(shù)據(jù)解析的完整性和準(zhǔn)確性高，序列分析接單、通用性強、成本低，特別適用于含有復(fù)雜外源DNA整合結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因生物的分子特征解析。同時，LIFE-Seq也可以進一步用于未知轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測和分子特征解析、及復(fù)雜基因組DNA結(jié)構(gòu)的分析。
楊立桃課題組近年來在轉(zhuǎn)基因生物分子特征識別和檢測方面取得了系列進展（J Agric Food Chem, 2021, 69, 1705?1713; ACS Agric. Sci. Technol. 2021, 1, 390?399; Food Chemistry: Molecular Sciences, 2022. 4 :100061），重點開發(fā)了系列轉(zhuǎn)基因作物外源DNA插入整合高通量、通用型精準(zhǔn)分析新方法和新技術(shù)。該研究獲得了國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項和上海高校特聘教授（東方學(xué)者）項目經(jīng)費的支持。
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原文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13776
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