NBT|李毓龍實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)新型熒光探針用于檢測(cè)內(nèi)源大麻素的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化
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人類(lèi)歷史上，大麻已被馴化并使用了數(shù)千年。完成于漢代的中國(guó)最古老的藥書(shū)《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載：“麻蕡（即大麻果實(shí)），味辛平。主五勞七傷，利五臟，下血，寒氣。多食，令人見(jiàn)鬼，狂走。久服，通神明，輕身”，這不僅介紹了大麻的藥學(xué)功效，還描述了人攝入大麻所引發(fā)的幻覺(jué)等精神活動(dòng)的變化。現(xiàn)在人們已經(jīng)知道，古書(shū)上所記載的大麻對(duì)人精神活動(dòng)的影響是由其天然成分大麻素類(lèi)分子進(jìn)入人體后作用在內(nèi)源大麻素系統(tǒng)而實(shí)現(xiàn)的。
圖一：大麻形態(tài)示意
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內(nèi)源大麻素（endocannabinoids, eCBs），包括花生四烯酸甘油酯（2-Arachidonoylgylcerol，簡(jiǎn)稱2-AG）和花生四烯酸乙醇胺（N-arachidonoylethanolamide，簡(jiǎn)稱AEA），是由神經(jīng)元合成和釋放的一類(lèi)脂類(lèi)神經(jīng)調(diào)質(zhì)分子。經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)從突觸前末梢釋放，激活突觸后膜受體；而eCB“反其道而行之”——在突觸后神經(jīng)元釋放，逆行性地作用在特定類(lèi)型神經(jīng)元突觸前膜大麻素受體CB1R（Cannabinoid receptor type 1）上，發(fā)揮突觸前抑制作用。近二十年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，eCB參與大腦多個(gè)腦區(qū)，包括皮層、海馬、紋狀體、杏仁核、下丘腦和黑質(zhì)等，的突觸可塑性調(diào)節(jié)，對(duì)維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能至關(guān)重要，與獎(jiǎng)賞行為、能量代謝、學(xué)習(xí)記憶、睡眠覺(jué)醒、情緒等多種生理過(guò)程密切相關(guān)。內(nèi)源大麻素系統(tǒng)的調(diào)控異常也與神經(jīng)退行性疾病、癲癇、成癮、抑郁癥和精神分裂癥等諸多神經(jīng)疾病和精神類(lèi)疾病密切相關(guān)。然而，目前缺乏高靈敏度、高時(shí)空分辨率的實(shí)驗(yàn)手段直接檢測(cè)在體eCB的動(dòng)態(tài)變化，極大地限制了人們對(duì)其在生理和病理狀態(tài)下重要功能和分子調(diào)控機(jī)理的研究。
2021年11月11日，北京大學(xué)、生命科學(xué)聯(lián)合中心李毓龍實(shí)驗(yàn)室在Nature Biotechnology雜志在線發(fā)表了題為A fluorescent sensor for spatiotemporally resolved imaging of endocannabinoid dynamics in vivo的研究論文，報(bào)道了新型基因編碼的內(nèi)源大麻素探針GRABeCB2.0的開(kāi)發(fā)和在體內(nèi)外多種場(chǎng)景下的應(yīng)用。李毓龍實(shí)驗(yàn)室自2018年以來(lái)，先后開(kāi)發(fā)了針對(duì)乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素、腺苷、五羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)/調(diào)質(zhì)的熒光探針，此次發(fā)表的GRABeCB2.0是其又一力作，進(jìn)一步擴(kuò)展了GRAB系列熒光探針家族。
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在這一工作中，李毓龍實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用其先前設(shè)計(jì)的GRAB探針策略 (GPCR activation-based sensor)，基于人源大麻素受體CB1R和循環(huán)重排的綠色熒光蛋白cpEGFP開(kāi)發(fā)了eCB探針eCB2.0。在體外培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞和原代神經(jīng)元中，eCB2.0探針均表現(xiàn)出良好的細(xì)胞膜定位，對(duì)外源加入的大麻素AEA和2-AG有亞微摩至微摩級(jí)的親和度，秒級(jí)的動(dòng)力學(xué)響應(yīng)和高度的分子特異性（圖二）。此外，eCB2.0探針不會(huì)激活GPCR下游信號(hào)通路，表明探針本身對(duì)細(xì)胞的正常生理活動(dòng)沒(méi)有明顯影響。
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圖二：eCB2.0在HEK293T細(xì)胞和原代神經(jīng)元上的表現(xiàn)
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那么，eCB2.0能否用來(lái)檢測(cè)神經(jīng)元釋放的eCB ？作者先從體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)元入手，證明eCB2.0能夠檢測(cè)到電刺激引發(fā)的來(lái)自神經(jīng)元的eCB釋放。通過(guò)藥理學(xué)方法，作者發(fā)現(xiàn)此時(shí)神經(jīng)元釋放的eCB類(lèi)型主要為2-AG。此外，作者還發(fā)現(xiàn)，即使不給予電刺激，也能記錄到離散分布的直徑約為10微米的自發(fā)性eCB2.0信號(hào)，表明eCB的釋放具有特異和局部的特性。在急性腦片這一更接近生理?xiàng)l件的體系中，電刺激和高鉀溶液刺激均能引起eCB的釋放，其局部釋放的特點(diǎn)也再次被驗(yàn)證：eCB2.0能夠以單個(gè)軸突扣結(jié)（bouton），即單個(gè)突觸的空間分辨率，檢測(cè)到海馬體CB1R陽(yáng)性神經(jīng)元上的eCB信號(hào)（圖三）。
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圖三：急性海馬體腦片上由高鉀溶液刺激引發(fā)及自發(fā)的內(nèi)源大麻素信號(hào)具有單個(gè)突觸的分辨率
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基底外側(cè)杏仁核（basolateral amygdala, BLA）是介導(dǎo)恐懼反應(yīng)和加工厭惡記憶的關(guān)鍵腦區(qū)。內(nèi)源大麻素受體CB1R在此處有高水平的表達(dá)。為了研究活體動(dòng)物在受到傷害刺激時(shí)BLA腦區(qū)處的eCB動(dòng)態(tài)變化，作者借助AAV病毒在小鼠BLA表達(dá)eCB2.0探針并使用光纖記錄的手段成功檢測(cè)到給予小鼠足部電擊時(shí)的BLA腦區(qū)中eCB的信號(hào)。另一方面，在海馬體CA1腦區(qū)，作者使用活體雙光子雙色顯微成像的方式，記錄了小鼠跑步時(shí)CA1區(qū)神經(jīng)元的鈣信號(hào)和eCB信號(hào)，發(fā)現(xiàn)跑步行為總是伴隨著CA1神經(jīng)元的興奮以及eCB信號(hào)的上升，表明eCB2.0探針能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)小鼠在生理?xiàng)l件下（運(yùn)動(dòng)過(guò)程中）大腦中內(nèi)源大麻素的動(dòng)態(tài)變化（圖四）。
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圖四：小鼠受到足部電擊時(shí)BLA腦區(qū)的內(nèi)源大麻素信號(hào)和小鼠跑步時(shí)海馬體CA1腦區(qū)的內(nèi)源大麻素信號(hào)
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當(dāng)大腦處于疾病狀態(tài)時(shí)，eCB的釋放又會(huì)呈現(xiàn)什么樣的變化呢？過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源大麻素系統(tǒng)受損的動(dòng)物易發(fā)癲癇。為了探究癲癇和eCB信號(hào)的聯(lián)系，作者構(gòu)建了癲癇模型小鼠，并借助雙光子成像記錄了小鼠癲癇發(fā)作時(shí)的神經(jīng)元活動(dòng)和eCB動(dòng)態(tài)。有意思的是，當(dāng)小鼠被誘導(dǎo)發(fā)生癲癇時(shí)，海馬體CA1區(qū)神經(jīng)元表現(xiàn)出劇烈的鈣信號(hào)活動(dòng)并伴隨強(qiáng)烈的eCB信號(hào)上升；更有意思的是，緊隨著癲癇發(fā)作后，作者在CA1腦區(qū)記錄到了沿著水平方向傳遞的強(qiáng)烈的“鈣波”信號(hào)和“eCB波”信號(hào)（見(jiàn)視頻）。
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視頻：小鼠癲癇發(fā)作前后的海馬體CA1腦區(qū)的內(nèi)源大麻素信號(hào)和鈣信號(hào)的變化，注意內(nèi)源大麻素波和鈣波的傳遞
總而言之，在這項(xiàng)工作中，作者首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)eCB的高時(shí)空間分辨率記錄，為科學(xué)界深入研究?jī)?nèi)源大麻素在生理和病理?xiàng)l件下的重要功能和調(diào)控機(jī)理提供了有力的新工具。
值得一提的是，這項(xiàng)研究的合作者美國(guó)斯坦福大學(xué)Ivan Soltesz實(shí)驗(yàn)室借助eCB2.0探針就內(nèi)源大麻素在大腦中的動(dòng)態(tài)及其在癲癇中的作用進(jìn)行了更進(jìn)一步的研究，相關(guān)成果同期發(fā)表在Neuron雜志上（Farrell et al, 2021）。
圖五：Ivan Soltesz實(shí)驗(yàn)室借助eCB2.0探針解析了活體動(dòng)物海馬體內(nèi)源大麻素信號(hào)的分子特性和時(shí)空動(dòng)態(tài)。他們發(fā)現(xiàn)，相較于正常生理活動(dòng)時(shí)，癲癇引起大量2-AG的釋放，而2-AG為長(zhǎng)時(shí)程的中風(fēng)樣癥狀提供了基礎(chǔ)底物（Farrell et al, 2021）。
生命科學(xué)聯(lián)合中心2021屆博士畢業(yè)生董傲為本文第一作者，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李毓龍教授為通訊作者。清華大學(xué)本科畢業(yè)生何凱凱、北京大學(xué)博士研究生蔡儒儀、王歡、本科畢業(yè)生段佳麗等對(duì)文章做出了重要貢獻(xiàn)。該工作得到了美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院David Lovinger實(shí)驗(yàn)室、美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室Bo Li實(shí)驗(yàn)室、美國(guó)斯坦福大學(xué)Jun Ding實(shí)驗(yàn)室和Ivan Soltesz實(shí)驗(yàn)室等團(tuán)隊(duì)的合作，并得到北京大學(xué)膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、生命科學(xué)聯(lián)合中心、國(guó)家自然科學(xué)基金、北京市科委及美國(guó)NIH腦計(jì)劃等機(jī)構(gòu)和經(jīng)費(fèi)的大力支持。
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更多李毓龍實(shí)驗(yàn)室工作詳見(jiàn)：
http://yulonglilab.org/
文章地址：
https://www.nature.com/articles/s41587-021-01074-4
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