最新研究成果 | 阿爾茨海默氏癥領域新突破 ｜清華大學藥學院魯白團隊開發(fā)出全球首個全面模擬人類阿爾茨海默癥的大鼠模型
時間：2021-11-20 15:23:42學院：藥學院學校：清華大學
很少有疾病能比阿爾茨海默氏癥(AD)，更能引起人們的恐懼和無奈。在過去的一個多世紀，研究人員已經(jīng)開展了400多項AD藥物臨床試驗，但迄今為止尚無一個治本（阻止疾病進程）的藥物可用。究其原因，很重要的一條是AD動物模型不能模擬人類AD病人的真實情況；從而導致有很多候選藥物在動物模型中有效，但在AD病人的臨床試驗中則無效。
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在過去的25年，科學家們相繼建立了200多個AD動物模型，但這些模型或者沒有神經(jīng)細胞的死亡，或者缺乏完整的病理特征。由于設計或技術方面的缺陷，迄今未能獲得一個真正能夠全面反映人類AD病理表型和疾病機制的動物模型，這在很大程度上妨礙了對AD的研究和臨床藥物開發(fā)。建立人源化，能夠全面模擬人類AD的動物模型，一直是AD領域機制研究和藥物開發(fā)亟需解決的一大難題。
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近日，由著名神經(jīng)科學家、清華大學藥學院教授魯白領導的團隊，在該領域實現(xiàn)了重大突破，成功開發(fā)了能夠全面模擬AD的基因敲入大鼠模型，相關成果日前以Article的形式在線發(fā)表在Cell Research期刊上。
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長期研究表明，大腦中淀粉樣蛋白的沉淀（Aβ沉淀，俗稱老年斑），是AD病人的主要病理表現(xiàn)，也被認為是AD發(fā)病的主要原因。而Aβ的前體App基因的一些突變，會大大加速Aβ沉淀。因此，以往絕大多數(shù)的AD模型，采用各種各樣的轉基因技術，將不同突變型的App基因表達在小鼠中。在這類App的轉基因小鼠中，可以觀察到Aβ沉淀，但看不到AD的另一特征tau的病理表型，也很少看到神經(jīng)元的死亡。另外，轉基因技術有一系列不可避免的的缺陷：將人類App突變基因隨機插入小鼠的染色體中，可能破壞插入處小鼠自身正常基因的表達；而插入的突變型App基因，也可能表達在錯誤的腦區(qū)，錯誤的細胞，或者錯誤的時間；最大的缺陷是導致App蛋白表達水平比正常水平高得多，這些過量的App蛋白會被酶切成Aβ和一些非生理的蛋白片段，它們會擾亂小鼠的正常生理功能，導致了與AD無關的表型。
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在這項研究中，魯白教授團隊刻意避免使用轉基因技術，而采用了CRISPR/Cas9基因敲入技術，在大鼠體內實現(xiàn)了人源App基因的替換，同時攜帶了Swedish, Beyreuther/Iberian和Arctic三個人類家族突變，（AppNL-G-F），而不改變App蛋白及其片段在腦內的時間和空間的表達水平。系統(tǒng)的病理學，細胞生物學和行為學研究表明，該模型與現(xiàn)有其他AD動物模型相比，顯示出與人類AD患者更相似的病理和疾病進展。
據(jù)該論文的第一作者逄克亮博士介紹，在大鼠中實現(xiàn)人源App基因的替換并同時進行多個家族突變的原位敲入很具挑戰(zhàn)。由于上述3個家系突變分布在App基因的兩個外顯子上，將它們同時準確無誤地敲入基因組并實現(xiàn)人源化，其成功率很低。公開文獻顯示，國際上有諾貝爾獎獲得者在內的多個團隊曾試圖進行類似App突變的敲入，均未成功。而魯白團隊也是在200多個App突變敲入大鼠系中，才篩選到了一個準確的AppNL-G-F敲入大鼠。
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研究人員在對該AppNL-G-F大鼠中App蛋白和多個酶切片段進行了詳細分析，證實該模型避免了以往轉基因模型中普遍存在的多種缺陷。文章顯示該大鼠模型在二月齡便顯現(xiàn)出Aβ的沉積，并隨著年齡呈現(xiàn)出多腦區(qū)的分布，呈現(xiàn)出非常類似于人類AD大腦中Aβ病理的進行性擴展。由此可見，用基因敲入術進行人源App基因的替換，既解決了傳統(tǒng)轉基因模型常見的Aβ過表達和非生理分布缺陷，又避免了基因隨機插入對原位基因表達的破壞性導致的死亡，因此更準確地模擬了AD大腦中病理發(fā)生機制。
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在AD病人大腦中，除了Aβ病理沉積，還有異常高的磷酸化tau蛋白以低聚物纖維形式存在，形成AD的第二個病理特征：神經(jīng)纖維纏繞。魯白團隊用4種方法證明，該大鼠模型大腦有類似于人類的高磷酸化的tau，以及病理性tau蛋白聚合物，一般在動物模型中很難觀察到Aβ和tau兩種病理的同時存在。在以往幾乎所有的App小鼠模型中都缺少tau病理表型。該結果揭示了Aβ病理和tau病理其潛在關系，只要有突變型Aβ在大鼠腦中的表達，就會有tau的病理出現(xiàn)。另外，該研究發(fā)現(xiàn)在時間上，tau病理發(fā)生在Aβ病理之后，這為Aβ致病假說提供了強有力的證據(jù)，也為繼續(xù)深入研究其中的機制提供了方向。
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人類AD大腦的第三個顯著變化是神經(jīng)細胞的進行性死亡和大腦萎縮（表現(xiàn)為腦室擴張），這也成為臨床上用磁共振 (MRI) 診斷AD的主要指征。而在以往的AD動物模型上，都不能模擬大腦萎縮這一關鍵疾病進展，即使細胞死亡也罕有報道。魯白團隊在對AppNL-G-F大鼠大腦宏觀和微觀上的系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)同時存在程序性凋亡（apoptosis）和程序性壞死（necroptosis）兩種發(fā)生于AD病人中的主要細胞死亡形式，并隨著疾病的進展表現(xiàn)出了腦組織重量減輕和腦室的擴張，這也是科學家首次在人類AD以外的動物模型中觀察到腦室的擴張。從AD發(fā)現(xiàn)至今100多年，但科學家們卻一直沒有找到AD患者神經(jīng)元死亡的確切原因，該AppNL-G-F大鼠為研究這一問題提供了工具。
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用基因敲入的方法建立AD動物模型，并非沒有被嘗試過。2014年，日本科學家Saido研究組用幾乎完全相同的策略，制作了基因敲入型AppNL-G-F小鼠模型。魯教授團隊將其研發(fā)的AppNL-G-F大鼠與Saido的AppNL-G-F小鼠做了頭對頭的比較研究。一個令人驚嘆的結果是，盡管AppNL-G-F小鼠展示了與AD比較相關的Aβ病理表型，與人類AD的病理特征相類似，但與AppNL-G-F大鼠模型不同，該小鼠模型欠缺AD患者大腦中的最關鍵的病理表現(xiàn)，即神經(jīng)細胞的持續(xù)性死亡，及其導致的腦萎縮（表現(xiàn)為腦室擴張）。此外，AD的另一個關鍵特征tau蛋白病理，也沒有在Saido小鼠中表現(xiàn)出來。該結果提示AppNL-G-F大鼠是更接近人類AD的動物模型。
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此外，研究人員發(fā)現(xiàn)在AppNL-G-F大鼠腦中膠質細胞的顯著活化。在海馬和大腦皮層，小膠質細胞和星形膠質細胞隨年齡增長而大量增生。尤為重要的是，小膠質細胞和星形膠質細胞在Aβ斑塊周圍聚集，這反映了與AD患者大腦類似，AppNL-G-F大鼠腦中也有顯著的神經(jīng)炎癥。
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AD大腦中的毒素 (Aβ和tau)沉積和神經(jīng)炎癥，會造成突觸的損傷乃至丟失。突觸損傷也被普遍認為AD從病理生理到認知障礙的關鍵改變點，是與認知狀態(tài)相關的最具有預測性的病理特征。魯白團隊綜合使用生化、免疫組化和三維電鏡等技術證明，該大鼠模型大腦有類似人類AD的突觸損傷和腦區(qū)特征。隨著目前針對清除有毒蛋白AD臨床治療絕大部分的失敗，修復突觸損傷是非常有前景的治療策略。魯白教授早在2013年便在Nature Reviews Neuroscience提出了針對神經(jīng)退行性疾病突觸修復和再生的治療方法，隨著越來越多的研究，被科學術界和工業(yè)界所公認。該AppNL-G-F大鼠動物模型的建立，將成為驗證基于突觸修復的新型治療策略的有效工具。
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最后，研究人員通過多種行為實驗范式，發(fā)現(xiàn)該模型大鼠全方位地出現(xiàn)了人類AD的空間記憶障礙、工作記憶障礙，等等。尤為重要的是，研究人員用一種精巧的更接近于人類行為的觸屏技術，證明AppNL-G-F大鼠具有明顯的情景記憶障礙。情景記憶的缺失是AD患者最早也是最為常見的行為表現(xiàn)，但在小鼠模型中應用觸屏技術卻很難。因此，該研究結果也展示了大鼠AD模型的另一優(yōu)越性。
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這項研究由清華大學魯白教授和逄克亮博士發(fā)起并領導。逄克亮博士為該論文第一作者，魯白團隊副研究員郭煒博士為共同通訊作者，聯(lián)合瑞典卡洛琳斯卡醫(yī)學院Per Nilsson研究組，中科院心理學研究所王瑋文研究組，中科院自動化研究所蔣田仔研究組和韓華研究組等多個科學家團隊通力合作，歷時數(shù)載，才成功地建立了全世界領先的AD模型。
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“此次構建的AD大鼠模型全面展現(xiàn)出AD的病理特征，將對目前近乎停滯的AD全球藥物臨床的成功轉化起到一定的促進作用”魯白教授指出?！八鼘槔斫釧D的發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)用于AD早期診斷的敏感生物標記物，尤其是創(chuàng)新藥物的療效，提供了不可或缺的工具。
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在過去的25年，科學家們相繼建立了200多個AD動物模型，但這些模型或者沒有神經(jīng)細胞的死亡，或者缺乏完整的病理特征。由于設計或技術方面的缺陷，迄今未能獲得一個真正能夠全面反映人類AD病理表型和疾病機制的動物模型，這在很大程度上妨礙了對AD的研究和臨床藥物開發(fā)。建立人源化，能夠全面模擬人類AD的動物模型，一直是AD領域機制研究和藥物開發(fā)亟需解決的一大難題。
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近日，由著名神經(jīng)科學家、清華大學藥學院教授魯白領導的團隊，在該領域實現(xiàn)了重大突破，成功開發(fā)了能夠全面模擬AD的基因敲入大鼠模型，相關成果日前以Article的形式在線發(fā)表在Cell Research期刊上。
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在這項研究中，魯白教授團隊刻意避免使用轉基因技術，而采用了CRISPR/Cas9基因敲入技術，在大鼠體內實現(xiàn)了人源App基因的替換，同時攜帶了Swedish, Beyreuther/Iberian和Arctic三個人類家族突變，（AppNL-G-F），而不改變App蛋白及其片段在腦內的時間和空間的表達水平。系統(tǒng)的病理學，細胞生物學和行為學研究表明，該模型與現(xiàn)有其他AD動物模型相比，顯示出與人類AD患者更相似的病理和疾病進展。
據(jù)該論文的第一作者逄克亮博士介紹，在大鼠中實現(xiàn)人源App基因的替換并同時進行多個家族突變的原位敲入很具挑戰(zhàn)。由于上述3個家系突變分布在App基因的兩個外顯子上，將它們同時準確無誤地敲入基因組并實現(xiàn)人源化，其成功率很低。公開文獻顯示，國際上有諾貝爾獎獲得者在內的多個團隊曾試圖進行類似App突變的敲入，均未成功。而魯白團隊也是在200多個App突變敲入大鼠系中，才篩選到了一個準確的AppNL-G-F敲入大鼠。
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研究人員在對該AppNL-G-F大鼠中App蛋白和多個酶切片段進行了詳細分析，證實該模型避免了以往轉基因模型中普遍存在的多種缺陷。文章顯示該大鼠模型在二月齡便顯現(xiàn)出Aβ的沉積，并隨著年齡呈現(xiàn)出多腦區(qū)的分布，呈現(xiàn)出非常類似于人類AD大腦中Aβ病理的進行性擴展。由此可見，用基因敲入術進行人源App基因的替換，既解決了傳統(tǒng)轉基因模型常見的Aβ過表達和非生理分布缺陷，又避免了基因隨機插入對原位基因表達的破壞性導致的死亡，因此更準確地模擬了AD大腦中病理發(fā)生機制。
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在AD病人大腦中，除了Aβ病理沉積，還有異常高的磷酸化tau蛋白以低聚物纖維形式存在，形成AD的第二個病理特征：神經(jīng)纖維纏繞。魯白團隊用4種方法證明，該大鼠模型大腦有類似于人類的高磷酸化的tau，以及病理性tau蛋白聚合物，一般在動物模型中很難觀察到Aβ和tau兩種病理的同時存在。在以往幾乎所有的App小鼠模型中都缺少tau病理表型。該結果揭示了Aβ病理和tau病理其潛在關系，只要有突變型Aβ在大鼠腦中的表達，就會有tau的病理出現(xiàn)。另外，該研究發(fā)現(xiàn)在時間上，tau病理發(fā)生在Aβ病理之后，這為Aβ致病假說提供了強有力的證據(jù)，也為繼續(xù)深入研究其中的機制提供了方向。
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人類AD大腦的第三個顯著變化是神經(jīng)細胞的進行性死亡和大腦萎縮（表現(xiàn)為腦室擴張），這也成為臨床上用磁共振 (MRI) 診斷AD的主要指征。而在以往的AD動物模型上，都不能模擬大腦萎縮這一關鍵疾病進展，即使細胞死亡也罕有報道。魯白團隊在對AppNL-G-F大鼠大腦宏觀和微觀上的系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)同時存在程序性凋亡（apoptosis）和程序性壞死（necroptosis）兩種發(fā)生于AD病人中的主要細胞死亡形式，并隨著疾病的進展表現(xiàn)出了腦組織重量減輕和腦室的擴張，這也是科學家首次在人類AD以外的動物模型中觀察到腦室的擴張。從AD發(fā)現(xiàn)至今100多年，但科學家們卻一直沒有找到AD患者神經(jīng)元死亡的確切原因，該AppNL-G-F大鼠為研究這一問題提供了工具。
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用基因敲入的方法建立AD動物模型，并非沒有被嘗試過。2014年，日本科學家Saido研究組用幾乎完全相同的策略，制作了基因敲入型AppNL-G-F小鼠模型。魯教授團隊將其研發(fā)的AppNL-G-F大鼠與Saido的AppNL-G-F小鼠做了頭對頭的比較研究。一個令人驚嘆的結果是，盡管AppNL-G-F小鼠展示了與AD比較相關的Aβ病理表型，與人類AD的病理特征相類似，但與AppNL-G-F大鼠模型不同，該小鼠模型欠缺AD患者大腦中的最關鍵的病理表現(xiàn)，即神經(jīng)細胞的持續(xù)性死亡，及其導致的腦萎縮（表現(xiàn)為腦室擴張）。此外，AD的另一個關鍵特征tau蛋白病理，也沒有在Saido小鼠中表現(xiàn)出來。該結果提示AppNL-G-F大鼠是更接近人類AD的動物模型。
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此外，研究人員發(fā)現(xiàn)在AppNL-G-F大鼠腦中膠質細胞的顯著活化。在海馬和大腦皮層，小膠質細胞和星形膠質細胞隨年齡增長而大量增生。尤為重要的是，小膠質細胞和星形膠質細胞在Aβ斑塊周圍聚集，這反映了與AD患者大腦類似，AppNL-G-F大鼠腦中也有顯著的神經(jīng)炎癥。
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AD大腦中的毒素 (Aβ和tau)沉積和神經(jīng)炎癥，會造成突觸的損傷乃至丟失。突觸損傷也被普遍認為AD從病理生理到認知障礙的關鍵改變點，是與認知狀態(tài)相關的最具有預測性的病理特征。魯白團隊綜合使用生化、免疫組化和三維電鏡等技術證明，該大鼠模型大腦有類似人類AD的突觸損傷和腦區(qū)特征。隨著目前針對清除有毒蛋白AD臨床治療絕大部分的失敗，修復突觸損傷是非常有前景的治療策略。魯白教授早在2013年便在Nature Reviews Neuroscience提出了針對神經(jīng)退行性疾病突觸修復和再生的治療方法，隨著越來越多的研究，被科學術界和工業(yè)界所公認。該AppNL-G-F大鼠動物模型的建立，將成為驗證基于突觸修復的新型治療策略的有效工具。
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最后，研究人員通過多種行為實驗范式，發(fā)現(xiàn)該模型大鼠全方位地出現(xiàn)了人類AD的空間記憶障礙、工作記憶障礙，等等。尤為重要的是，研究人員用一種精巧的更接近于人類行為的觸屏技術，證明AppNL-G-F大鼠具有明顯的情景記憶障礙。情景記憶的缺失是AD患者最早也是最為常見的行為表現(xiàn)，但在小鼠模型中應用觸屏技術卻很難。因此，該研究結果也展示了大鼠AD模型的另一優(yōu)越性。
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這項研究由清華大學魯白教授和逄克亮博士發(fā)起并領導。逄克亮博士為該論文第一作者，魯白團隊副研究員郭煒博士為共同通訊作者，聯(lián)合瑞典卡洛琳斯卡醫(yī)學院Per Nilsson研究組，中科院心理學研究所王瑋文研究組，中科院自動化研究所蔣田仔研究組和韓華研究組等多個科學家團隊通力合作，歷時數(shù)載，才成功地建立了全世界領先的AD模型。
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