胡晉川/錢茂祥課題組《Nucleic Acids Research 》合作開發(fā)單堿基分辨率DNA氧化損傷測(cè)序方法
?生命活動(dòng)需要氧化反應(yīng)提供能量，這一過程同時(shí)會(huì)產(chǎn)生活性氧物質(zhì)（ROS）。ROS能誘導(dǎo)多種DNA氧化損傷，其中最常見的是8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine?(OG)，被視為氧化壓力的標(biāo)志物。如果沒有被及時(shí)修復(fù)，OG可能引起G→T突變，與多種癌癥、神經(jīng)退行性疾病和衰老相關(guān)。除此之外，OG也有類似于表觀遺傳修飾的作用，可以通過幾種不同的方式調(diào)控基因表達(dá)，例如OG的修復(fù)中間體apurinic?(AP)?site可以通過促進(jìn)和穩(wěn)定富含G堿基的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)G四鏈體（G-quadruplexes, G4）來影響轉(zhuǎn)錄。
?OG的上述生物學(xué)功能與其在基因組上的分布密切相關(guān)，因此檢測(cè)OG在基因組上準(zhǔn)確位置對(duì)研究相關(guān)科學(xué)問題有重要意義。2021年11月12日，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院的胡晉川課題組和錢茂祥課題組合作在Nucleic Acids Research?雜志在線發(fā)表了題為Genome-wide analysis of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine at single-nucleotide resolution unveils reduced occurrence of oxidative damage at G-quadruplex sites?的研究論文，開發(fā)了一種能以單堿基分辨率特異性檢測(cè)OG損傷的測(cè)序方法CLAPS-seq?(Chemical Labeling And Polymerase Stalling Sequencing)，檢測(cè)了HeLa細(xì)胞中內(nèi)源和外源OG損傷的分布，發(fā)現(xiàn)了G4結(jié)構(gòu)會(huì)阻礙OG損傷的形成。
?OG損傷的測(cè)序有幾個(gè)技術(shù)難題，首先內(nèi)源OG損傷的頻率小于每百萬堿基一個(gè)，實(shí)現(xiàn)特異性和單堿基分辨率具有很高的挑戰(zhàn)性；其次G堿基很容易被氧化，如何避免樣品處理過程中次生氧化的干擾是所有OG檢測(cè)方法的共同困難。CLAPS-seq在提取DNA之后，立即通過一個(gè)高選擇性的化學(xué)反應(yīng)給OG標(biāo)記上生物素，從而避免了后續(xù)處理過程中次生氧化的干擾。生物素標(biāo)記的DNA片段被鏈霉親和素磁珠捕捉，隨后用高保真DNA聚合酶進(jìn)行引物延伸。因?yàn)榫酆厦笗?huì)被準(zhǔn)確阻擋在損傷前一位堿基，對(duì)延伸產(chǎn)物測(cè)序可以確定損傷的準(zhǔn)確位置（圖2）。從測(cè)序結(jié)果看，無論是內(nèi)源損傷還是外源損傷，檢測(cè)到的損傷位點(diǎn)上大部分堿基都是G，表明CLAPS-seq首次實(shí)現(xiàn)了以單堿基分辨率檢測(cè)人類細(xì)胞中內(nèi)源OG損傷的準(zhǔn)確分布。
?作者分析了OG損傷與局部GC含量、染色質(zhì)狀態(tài)以及基因分布的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在GC富集的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近OG反而比較少，且OG與G4結(jié)構(gòu)的分布具有負(fù)相關(guān)性；另一方面，沒有形成G4結(jié)構(gòu)的“潛在四鏈體序列”（Potential Quadruplex Sequence, PQS）卻成為OG的熱點(diǎn)。這些結(jié)果為OG和G4的關(guān)系提示了一種可能的機(jī)制：由于G4結(jié)構(gòu)上的OG難以被修復(fù)，G4結(jié)構(gòu)抑制OG形成可以降低突變的風(fēng)險(xiǎn)，保護(hù)基因組的完整性；與之相反，未形成G4的PQS上的OG可以被正常識(shí)別，其修復(fù)中間體AP位點(diǎn)可以促進(jìn)G4結(jié)構(gòu)的形成，從而起到氧化壓力感受器的作用，調(diào)控下游基因表達(dá)（圖3）。
?復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院青年研究員胡晉川和錢茂祥是論文的共同通訊作者，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院19級(jí)博士研究生安嬌、研究助理殷夢(mèng)蝶和19級(jí)碩士研究生尹家勇為論文的共同第一作者，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院徐國(guó)良教授和美國(guó)北卡大學(xué)教堂山分校醫(yī)學(xué)院Aziz Sancar教授為本研究提供了重要幫助。
原文鏈接：
https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkab1022/6426063
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