鄭鵬課題組eLife報(bào)道新冠突變研究工作并被世衛(wèi)報(bào)告引用
新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)在過(guò)去不到兩年的時(shí)間里在全世界蔓延，目前超過(guò)2億人次被感染，四百萬(wàn)人因此失去生命，給人類社會(huì)造成了巨大的危害。而新冠病毒（SARS-CoV-2）是導(dǎo)致該疾病的主要病原體。作為一種單鏈RNA病毒，SARS-CoV-2的突變速度很快。近期各地出現(xiàn)的多種不同的新冠病毒變異株讓疫情雪上加霜。為了最終戰(zhàn)勝病毒保護(hù)人類，科研和醫(yī)務(wù)工作者作出了巨大的努力研究病毒的傳播機(jī)制、感染特點(diǎn),致力于開發(fā)相應(yīng)的快速檢測(cè)、免疫和治療方法。目前已知，病毒感染人體的第一步，是由病毒上刺突蛋白Spike的受體結(jié)合域(RBD)與人類血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)之間，通過(guò)氨基酸的非共價(jià)相互作用結(jié)合。因此RBD蛋白結(jié)構(gòu)上的氨基酸的種類決定了其黏附人體受體細(xì)胞的強(qiáng)度和能力。而近期出現(xiàn)的多種具有更強(qiáng)傳染性和潛在危害的新冠變異株在RBD部位都出現(xiàn)了氨基酸突變。例如在變異株Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)和Gamma（P.1）的刺突蛋白RBD區(qū)域都出現(xiàn)了N501Y的氨基酸突變，該突變可能是導(dǎo)致病毒對(duì)人類具有更強(qiáng)的傳染性的原因之一。
南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院鄭鵬教授與生命科學(xué)學(xué)院董咸池教授、童貝老師合作，利用單細(xì)胞力譜技術(shù)(Single-cell Force Spectroscopy)、分子動(dòng)力學(xué)模擬和經(jīng)典的蛋白結(jié)合動(dòng)力學(xué)測(cè)量技術(shù)，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)和理論相結(jié)合、多學(xué)科多手段的交叉研究工作。通過(guò)定量測(cè)量和原子水平的分子動(dòng)力學(xué)模擬，發(fā)現(xiàn)RBD結(jié)構(gòu)域上的N501Y突變導(dǎo)致這些變異株具有更強(qiáng)結(jié)合人體受體蛋白ACE2的能力，極大的提高了病毒黏附細(xì)胞的強(qiáng)度和概率，可能是導(dǎo)致這幾類類新冠變異株病毒在最近一年廣為擴(kuò)散的重要原因之一。值得一提的是，該研究成果被八月份剛出版的世界衛(wèi)生組織(WHO)新冠變異株監(jiān)控報(bào)告所引用，作為介紹該突變影響的重要參考文獻(xiàn)(https://apps.who.int/iris/handle/10665/343775)。
圖1. 熒光定量檢測(cè)揭示N501Y突變與ACE2具有較高的結(jié)合親和力?
在文章中，作者首先通過(guò)經(jīng)典的表面等離子體共振（SPR）和熒光激活細(xì)胞掃描檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Alpha變體的N501Y突變與細(xì)胞表面ACE2的結(jié)合親和力約為野生型RBD蛋白的4倍，而Beta型的三突變（N501Y、K417N和E484K）RBD蛋白與野生型的親和力相似，且單個(gè)的K417N和E484K突變也表現(xiàn)出略弱或相似的親和力。基于以上表明，N501Y的突變，是RBD蛋白結(jié)合ACE2具有較高結(jié)合親和力的關(guān)鍵氨基酸。
圖2. 單細(xì)胞力譜實(shí)驗(yàn)定量測(cè)量各類RBD突變體結(jié)合ACE2的強(qiáng)度和概率?
進(jìn)一步，作者采用基于原子力顯微鏡的單細(xì)胞力譜技術(shù)（Atomic force microscopy-based single cell force spectroscopy, AFM-SCFS）定量測(cè)量了各類RBD蛋白突變體在活細(xì)胞表面的結(jié)合強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)利用天冬酰胺連接酶OaAEP1酶連的方法將不同的RBD蛋白特異性的固定在AFM的針尖上，通過(guò)針尖移動(dòng)去接觸細(xì)胞表面的ACE2，從而精準(zhǔn)的測(cè)量RBD-ACE2蛋白之間的相互作用力。通過(guò)測(cè)量得到兩種突變蛋白與ACE2的結(jié)合力約為60 pN。相比于野生型蛋白（49 pN），其結(jié)合力明顯提高約15%。同時(shí)在相同條件下測(cè)量了突變體以及野生型與ACE2的結(jié)合概率，突變蛋白與ACE2的結(jié)合概率（約10%）也明顯大于野生型的RBD蛋白（3%）。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)顯示出兩種突變體都具有更高的結(jié)合力和結(jié)合概率。
圖3. 拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬揭示各類RBD-ACE2復(fù)合物相互作用的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)
最后，文章對(duì)RBD-ACE2復(fù)合物進(jìn)行了拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬（SMD），從原子水平揭示了復(fù)合物相互作用可能的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。通過(guò)模擬發(fā)現(xiàn)，RBD蛋白N501Y的突變，與ACE2上的Y41和K353氨基酸，分別形成了穩(wěn)定的π-π、陽(yáng)離子-π相互作用，從而加強(qiáng)了他們之間的相互作用。綜上所述，這項(xiàng)工作發(fā)現(xiàn)了新冠病毒變異株種RBD的N501Y突變導(dǎo)致其與人體受體細(xì)胞ACE2的結(jié)合強(qiáng)度和概率都大為提高，是這些變異株具有更高傳率的重要原因之一。同時(shí)該工作也揭示了RBD區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸突變是提高新冠病毒變異株感染率的原因之一。我們必須對(duì)該蛋白區(qū)域的氨基酸突變保持警惕和監(jiān)控，從而更好的預(yù)防和應(yīng)對(duì)將來(lái)可能出現(xiàn)的更具有危害性的新冠病毒變異株。
相關(guān)研究成果以“N501Y Mutation of Spike Protein in SARS-CoV-2 Strengthens its Binding to Receptor ACE2”為題在線發(fā)表在國(guó)際著名期刊eLife上(https://elifesciences.org/articles/69091)。南京大學(xué)2018級(jí)博士生田芳與生命科學(xué)學(xué)院童貝為本文的共同第一作者。此項(xiàng)研究得到了配位化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、南京大學(xué)化學(xué)和生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院(ChemBIC)和南京大學(xué)高性能計(jì)算中心的大力支持，也得到了國(guó)家自然科學(xué)基金和江蘇省自然科學(xué)基金等經(jīng)費(fèi)的支持。?
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