林金星教授團(tuán)隊(duì)在植物膜蛋白動(dòng)態(tài)計(jì)算方面發(fā)表高質(zhì)量綜述論文
近日，北京林業(yè)大學(xué)林木分子設(shè)計(jì)育種高精尖創(chuàng)新中心和生物學(xué)院林金星教授受邀在植物學(xué)權(quán)威學(xué)術(shù)期刊Annual Review of Plant Biology撰寫(xiě)題為 “Exploring the Spatiotemporal Organization of Membrane Proteins in Living Plant Cells”的綜述文章 (IF=22.8)，對(duì)在活體狀態(tài)下植物膜蛋白動(dòng)態(tài)、聚合狀態(tài)及蛋白互作的單分子分析技術(shù)進(jìn)行了總結(jié)，對(duì)這些單分子分析技術(shù)在植物生物學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)行了深入探討，并提出了有效的分析方法。
植物膜蛋白在物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但在活體條件下研究和分析膜蛋白的動(dòng)態(tài)過(guò)程、分子間相互作用則非常困難。林金星教授研究團(tuán)隊(duì)率先建立了適合于植物活細(xì)胞觀(guān)察的單分子分析平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了在體、原位條件下膜蛋白聚合狀態(tài)以及蛋白互作的納米和毫秒級(jí)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)。十多年來(lái)，通過(guò)單分子技術(shù)相繼對(duì)植物中的PIP2;1 (Li et al., Plant Cell, 2011), Flot1 (Li et al., Plant Cell, 2012), AMT1;3 (Wang et al., PNAS, 2013), AP2 σ (Fan et al., Development, 2013), Phot1 (Wan et al., Plant Cell, 2014), RbohD (Hao et al., Plant Cell, 2014), BRI1 (Wang et al., Molecular Plant, 2015) 等膜蛋白的擴(kuò)散和駐留時(shí)間等動(dòng)態(tài)參數(shù)進(jìn)行了檢測(cè)和分析。此外, 還通過(guò)優(yōu)化單分子技術(shù)，分析了活體狀態(tài)下膜蛋白的聚合狀態(tài) (Wang et al., Nature Protocols, 2015)，并建立了一些重要細(xì)胞器膜蛋白的單分子檢測(cè)技術(shù)方法 (Lv et al., Molecular Plant, 2017)。在過(guò)去這些研究的基礎(chǔ)上，該綜述著重分四部分評(píng)述了植物膜蛋白單分子研究技術(shù)，包括標(biāo)記技術(shù)、單分子成像技術(shù)、膜蛋白聚合體和互作的動(dòng)態(tài)計(jì)算方法，以及這些技術(shù)在植物生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。
由于單個(gè)分子的熒光很弱，并且容易受到背景噪音的干擾，因此要實(shí)現(xiàn)單分子成像，對(duì)膜蛋白進(jìn)行有效標(biāo)記至關(guān)重要。該綜述的第一部分除了介紹常規(guī)的標(biāo)記方法，譬如小分子染料和納米熒光顆粒標(biāo)記(量子點(diǎn)QD)等技術(shù)外，還重點(diǎn)敘述了熒光蛋白的標(biāo)記(如GFP、mCherry、DsRed-E5、光激活蛋白PA-GFP和Dronpa)，以及它們?cè)趯?shí)際應(yīng)用中需要注意的問(wèn)題。
第二部分闡述了標(biāo)記后蛋白的單分子追蹤和成像技術(shù)，包括激光共聚焦顯微鏡、超高分辨顯微鏡和寬場(chǎng)顯微鏡等。雖然常規(guī)的共聚焦顯微鏡的分辨率不能達(dá)到單分子檢測(cè)要求，但如果配置高靈敏度的檢測(cè)器，結(jié)合相應(yīng)的分析系統(tǒng)，譬如熒光相關(guān)光譜(FCS)、熒光互相關(guān)光譜(FCCS)和熒光能量共振偏移(FRET)技術(shù)等，也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單分子的追蹤、動(dòng)態(tài)分析以及膜蛋白狀態(tài)的檢測(cè)。該綜述除了介紹2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予的超分辨顯微術(shù)(STED、STORM、PALM等)以外，重點(diǎn)介紹了適合于植物細(xì)胞膜蛋白分析的可變角度-全內(nèi)反射熒光顯微鏡(VA-TIRFM)的原理及其應(yīng)用。
綜述的第三部分詳細(xì)介紹了在標(biāo)記和成像基礎(chǔ)上，測(cè)定膜蛋白聚合狀態(tài)和動(dòng)力學(xué)特征的主要方法：(1)通過(guò)熒光強(qiáng)度的分析技術(shù)，包括FIDA、PCH、SpIDA技術(shù)；(2)通過(guò)熒光漂白的分析技術(shù)，包括smSubunit-counting和smFRAP技術(shù)；(3)通過(guò)熒光漲落及熒光共振能量轉(zhuǎn)移的分析技術(shù)，包括FCS/FCCS、FRET-FLIM技術(shù)；(4)通過(guò)蛋白共定位和相互作用的分析技術(shù)，包括單分子水平的蛋白接近指數(shù)分析技術(shù)(smPPI)和單分子水平的pull-down 技術(shù)。
圖1植物細(xì)胞中膜蛋白聚合狀態(tài)的動(dòng)態(tài)計(jì)算技術(shù)模式圖
綜述的最后一部分簡(jiǎn)要敘述了在信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中，單分子技術(shù)用于檢測(cè)膜蛋白聚合與活化狀態(tài)、動(dòng)態(tài)變化與膜筏關(guān)系、動(dòng)力學(xué)特征與細(xì)胞骨架關(guān)系，以及不同環(huán)境條件下膜蛋白密度、駐留時(shí)間、胞吞途徑和轉(zhuǎn)運(yùn)速率、細(xì)胞骨架和細(xì)胞壁對(duì)膜蛋白聚合體形成的動(dòng)態(tài)調(diào)控等方面的應(yīng)用，為植物膜蛋白的研究提供了新思路。
該綜述已于4月6日在線(xiàn)發(fā)表(https://doi.org/10.1146/annurev-arplant-042817-040233)。林金星教授為論文的通訊作者，該團(tuán)隊(duì)成員、現(xiàn)為揚(yáng)州大學(xué)副教授王莉?yàn)檎撐牡牡谝蛔髡?，團(tuán)隊(duì)成員薛軼群、邢晶晶和宋凱博士為論文的其他作者。該論文得到了北京林木分子設(shè)計(jì)育種高精尖創(chuàng)新中心和國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目的資助。
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