李賽研究員應(yīng)邀在國際知名學(xué)術(shù)期刊發(fā)表cryo-ET解析囊膜病毒結(jié)構(gòu)的研究綜述
囊膜病毒門類眾多，其中不乏臭名昭著之輩，例如埃博拉病毒（Ebola），艾滋病病毒（HIV），流感病毒（influenza），以及新冠病毒等（SARS-CoV-2 virus）。研究其結(jié)構(gòu)，入侵機(jī)制以及生命周期是針對性開發(fā)疫苗、抗體以及藥物的基礎(chǔ)，一直是結(jié)構(gòu)生物學(xué)屆的熱點問題。但由于囊膜病毒往往具有多態(tài)性，這給結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究帶來了挑戰(zhàn)。與此同時，其較小的尺寸（直徑100nm或者更?。┮步o在細(xì)胞內(nèi)直接觀察這些病毒的生命周期帶來了難點?；仡欉^去二十年來，cryo-ET技術(shù)與結(jié)構(gòu)病毒學(xué)協(xié)同發(fā)展，相互促進(jìn)：為在動態(tài)組裝、多形的囊膜病毒上直接解析高分辨蛋白結(jié)構(gòu)，分子cryo-ET方向向高通量、高分辨方向發(fā)展；為一窺病毒在細(xì)胞中的生命活動，細(xì)胞cryo-ET方向新型特異性生物標(biāo)記、冷凍光電聯(lián)合成像（cryo-CLEM）、冷凍聚焦離子束減?。╟ryo-FIB milling）等方向發(fā)展。2020年，cryo-ET為全面展示新冠病毒完整結(jié)構(gòu)、組裝規(guī)律、病變細(xì)胞結(jié)構(gòu)等方面做出了卓越的貢獻(xiàn)，已在頂尖刊物發(fā)表多篇文章，其中包括2020年9月李賽實驗室解析的完整新冠病毒三維結(jié)構(gòu)。
2021年9月10日，清華大學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心李賽研究員應(yīng)邀在國際知名學(xué)術(shù)期刊Trends in Biochemical Sciences的冷凍電鏡特刊發(fā)表題為《囊膜病毒研究中的冷凍電鏡斷層成像技術(shù)》（Cryo-electron tomography of enveloped viruses）的綜述文章，系統(tǒng)總結(jié)了冷凍電鏡斷層成像技術(shù)（cryo-ET）在解析危險的囊膜病毒結(jié)構(gòu)，揭示其組裝和生命周期機(jī)制等研究中的應(yīng)用。文章也系統(tǒng)總結(jié)了近年來cryo-ET技術(shù)在分辨率方面的提升，應(yīng)用范圍上的擴(kuò)展，并對其未來發(fā)展進(jìn)行了展望。
蓬勃發(fā)展的cryo-ET技術(shù)及原位結(jié)構(gòu)生物學(xué)
原位結(jié)構(gòu)生物學(xué)的目標(biāo)是將超大蛋白質(zhì)機(jī)器從生物膜、病毒、細(xì)胞、甚至組織環(huán)境中直接解析，以獲得其在體結(jié)構(gòu)、與核酸/生物膜的互作關(guān)系及分布信息。原位結(jié)構(gòu)生物學(xué)核心技術(shù)是cryo-ET：它是將置于透射電鏡樣品臺上的冷凍樣品沿固定軸旋轉(zhuǎn)，并從多個角度拍照獲得傾轉(zhuǎn)系列（tilt series, TS），將其重構(gòu)為三維斷層圖像，再使用子斷層平均法（sub-tomogram averaging, STA）進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析的新型結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法。過去10年，為解決不同尺度的結(jié)構(gòu)生物學(xué)問題，cryo-ET領(lǐng)域也開發(fā)出一系列樣品制備、蛋白定位、數(shù)據(jù)分析等配套技術(shù)，它們包括：快速投入式冷凍制樣、高壓冷凍制樣、冷凍光電聯(lián)合成像（cryo-CLEM）、電鏡可見的特異性生物標(biāo)記、冷凍聚焦離子束減?。╟ryo-FIB milling）、相位板（VPP）、基于人工智能的圖像識別、降噪和圖形分割等?，F(xiàn)今，cryo-ET不再僅指采集傾轉(zhuǎn)系列數(shù)據(jù)的方法，而成為一種包納上述多種前沿技術(shù)的獨立的結(jié)構(gòu)生物學(xué)方向。
相比傳統(tǒng)的冷凍電鏡方法，cryo-ET的原始數(shù)據(jù)增加了精確的Z軸信息，因此對樣品純度及組裝嚴(yán)格性要求較低，且在制備樣品過程中無需使其脫離原生環(huán)境，獲得的結(jié)構(gòu)更具生理意義。Cryo-ET的這些特點恰好與傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法互補，擅長提供的結(jié)構(gòu)信息有：1）蛋白在其載體上或功能狀態(tài)中的原位結(jié)構(gòu)；2）大分子復(fù)合物的高級結(jié)構(gòu)，包括蛋白組裝、蛋白/脂膜間互作信息；3）不易重組表達(dá)的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。因此，cryo-ET的應(yīng)用范疇非常廣泛，未來在結(jié)構(gòu)生物學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，微生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域?qū)⒂兄陵P(guān)重要的地位。隨著它的日益完善，從病毒到細(xì)菌、細(xì)胞甚至組織維度間的結(jié)構(gòu)生物學(xué)空白將得到填補（圖1）。然而，它也是一門年輕的技術(shù)，在每年發(fā)表的電鏡結(jié)構(gòu)里僅做出不到20%的貢獻(xiàn)：主要是由于其采樣費時，圖像處理方法不完善等原因所導(dǎo)致的低分辨率（~20-40?），這也成為該領(lǐng)域亟待解決的難題。
圖1：結(jié)構(gòu)生物學(xué)以及顯微技術(shù)的對比
Cryo-ET解析蛋白質(zhì)復(fù)合物高分辨結(jié)構(gòu)需要收集含有數(shù)萬個目標(biāo)復(fù)合物的照片，因此，在細(xì)胞等原位環(huán)境中高效的尋找目標(biāo)復(fù)合物是原位結(jié)構(gòu)生物學(xué)的前提。然而，蛋白質(zhì)復(fù)合物、病毒與細(xì)胞、組織之間存在巨大的尺寸差異，而且細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境極為擁擠、嘈雜，這給尋找目標(biāo)復(fù)合物帶來了巨大挑戰(zhàn)。舉例說明，由于尺寸比例近似，在細(xì)胞中找到一顆病毒的難度好比在黃昏時滿是人群的足球場找到一顆足球。因此，僅使用冷凍電鏡在細(xì)胞中“碰運氣”式的尋找目標(biāo)復(fù)合物將極為低效。目前有多種方案解決這個問題，目標(biāo)均是在細(xì)胞中實現(xiàn)單分子的定位精度，它們可分為兩類：1）新型特異性生物標(biāo)記；2）CLEM將光學(xué)顯微鏡與電鏡關(guān)聯(lián)。然而，這些技術(shù)目前仍然停留在探索開發(fā)階段，離普適性應(yīng)用還遠(yuǎn)。此外，目前cryo-ET主要依靠手動采集數(shù)據(jù)，費時費力，數(shù)據(jù)品質(zhì)非常依賴采集者經(jīng)驗；使用新一代K3高速相機(jī)，每天可產(chǎn)生5-10TB數(shù)據(jù)，給計算及儲存帶來極大壓力；且采集數(shù)據(jù)到獲得結(jié)構(gòu)，整個流程需使用十幾種程序，其中大量步驟依賴手動和經(jīng)驗，耗時更可達(dá)單顆粒平均法百倍。這些低效、手動、長學(xué)習(xí)曲線、低分辨等特征，極大限制了cryo-ET技術(shù)和原位結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。
Cryo-ET是揭示囊膜病毒結(jié)構(gòu)、膜融合過程的利器
李賽研究員在綜述中系統(tǒng)闡述了cryo-ET和STA作為囊膜病毒研究中的有力工具。Cryo-ET技術(shù)不僅能重構(gòu)病毒的完整結(jié)構(gòu)組裝（圖2），還可提供組成病毒的各類結(jié)構(gòu)蛋白的原位高分辨結(jié)構(gòu)，如糖蛋白、基質(zhì)蛋白等。其中病毒表面糖蛋白是病毒入侵細(xì)胞的關(guān)鍵分子、免疫防御的重要靶標(biāo)，因而在結(jié)構(gòu)蛋白研究中最受關(guān)注，cryo-ET技術(shù)則為科學(xué)界提供了有關(guān)糖蛋白的大量結(jié)構(gòu)信息。例如，對于新冠病毒表面刺突蛋白，李賽課題組在2020年通過cryo-ET解析原位結(jié)構(gòu)并發(fā)現(xiàn)這個蛋白會在病毒表面以一個較大的角度進(jìn)行擺動。又如，丙型流感病毒表面糖蛋白HEF會在原位形成六聚的高聚結(jié)構(gòu)，使得在原位上，HEF蛋白的頭部比晶體結(jié)構(gòu)中有更多的旋轉(zhuǎn)和擴(kuò)大（圖3）。這些原位結(jié)構(gòu)的解析為疫苗、抗體的研發(fā)提供了病毒在天然狀態(tài)下的更多細(xì)節(jié)。
同時，文章翔實歸納了cryo-ET技術(shù)是如何貢獻(xiàn)于體外模擬膜融合、及融合過程中糖蛋白構(gòu)象變化的相關(guān)研究。例如，傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)研究方法限制了糖蛋白不能處于原位的膜環(huán)境、從而降低了解析膜融合過程的可靠性，而cryo-ET技術(shù)恰好彌補了這一缺憾。李賽研究員曾利用酸化孵育條件誘導(dǎo)裂谷熱病毒糖蛋白發(fā)生構(gòu)象變化、介導(dǎo)與脂質(zhì)體發(fā)生膜融合，并運用cryo-ET技術(shù)成功在孵育30秒的時間點捕捉并解析了裂谷熱病毒糖蛋白變構(gòu)插入脂質(zhì)體的中間結(jié)構(gòu)。由此可以窺見cryo-ET技術(shù)使得更多復(fù)雜體外條件的結(jié)構(gòu)解析變?yōu)榭赡?，展現(xiàn)了寬廣的應(yīng)用場景。
圖2：通過cryo-ET和STA解析的多種囊膜病毒結(jié)構(gòu)
圖3：通過cryo-ET和STA解析的多種囊膜病毒刺突蛋白原位結(jié)構(gòu)
Cryo-ET將病毒在病變細(xì)胞中的生命活動從通路圖變成真實結(jié)構(gòu)
研究病毒的生命周期：入侵，釋放基因組，復(fù)制，組裝，釋放等一直以來是病毒學(xué)研究的重點和難點，也為抗病毒靶點的篩選與抗病毒機(jī)制的研究提供了依據(jù)。李賽研究員在綜述中系統(tǒng)闡述了cryo-ET在觀察病毒生命周期中的應(yīng)用成果。例如利用cryo-ET研究正義鏈RNA病毒發(fā)現(xiàn)，這些病毒大多數(shù)在感染細(xì)胞后會改變細(xì)胞的膜系統(tǒng)，從而在胞內(nèi)形成一類被稱為“病毒工廠”的囊泡結(jié)構(gòu)來進(jìn)行病毒核酸的復(fù)制。文中同時也歸納了目前細(xì)胞cryo-ET技術(shù)在制樣、標(biāo)記、數(shù)據(jù)采集和處理上層出不窮的新技術(shù)。隨著這些技術(shù)的開發(fā)，cryo-ET技術(shù)在未來具有更加廣闊的應(yīng)用前景。
清華大學(xué)生命學(xué)院，結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心，清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心李賽研究員是本綜述作者，該研究受到清華大學(xué)未來疫苗中心、清華大學(xué)春風(fēng)基金的支持。實驗室長期尋找數(shù)理背景強(qiáng)，對顯微鏡、圖像處理感興趣的同學(xué)加入課題組，從事cryo-ET開發(fā)。
原文鏈接:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000421001857
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李賽，清華大學(xué)生命學(xué)院，結(jié)構(gòu)生物學(xué)高精尖創(chuàng)新中心，清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心，清華大學(xué)NexVac未來疫苗中心
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