張奇?zhèn)?師明磊/李婷婷/陳陽團隊開發(fā)出 定量測定生理條件下染色質(zhì)相關(guān)蛋白相分離特性的新方法 時間：2021-08-23
細胞核主要由DNA、RNA和蛋白質(zhì)等成分組成，是基因存儲、復制與調(diào)控的中心。在細胞核內(nèi)，蛋白質(zhì)等生物大分子通過液-液相分離（liquid-liquid phase separation, LLPS）形成生物分子凝聚體，已經(jīng)被報道與基因表達1、染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)2等緊密相關(guān)。然而，目前鑒定與評估蛋白相分離特性主要依賴于體內(nèi)外凝聚體形態(tài)、光漂白恢復實驗等定性或低通量方法，如何系統(tǒng)性地、定量測定生理條件下染色質(zhì)相關(guān)蛋白相分離特性，是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的問題。
近日，清華大學醫(yī)學院/北京信息國家研究中心張奇?zhèn)パ芯拷M師明磊與北京大學基礎(chǔ)醫(yī)學院李婷婷研究組，以及中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所陳陽合作在Genome Biology雜志上在線發(fā)表文章“Quantifying the phase separation property of chromatin-associated proteins under physiological conditions using an anti-1,6-hexanediol index”，開發(fā)了能定量描述生理狀態(tài)下染色質(zhì)相關(guān)蛋白相分離特性的新方法。
在該工作中，作者基于此前開發(fā)的染色質(zhì)構(gòu)象捕獲技術(shù)BL-Hi-C 3，開發(fā)出富集染色質(zhì)相關(guān)蛋白的新方法Hi-MS（圖1）。預實驗表明Hi-MS在使用較低的細胞量（107）時，也具有較好的靈敏性和特異性。
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圖1、?BL-Hi-C方法富集基因啟動子/增強子等調(diào)節(jié)元件以及所結(jié)合的蛋白質(zhì)，進行蛋白質(zhì)譜和Hi-C二代測序可分別得到蛋白質(zhì)組與三維基因組信息。
1,6-己二醇（1,6-Hexanediol，1,6-HD）具有適度的疏水相互作用干擾能力，能在不破壞生物膜結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上使相分離凝聚體發(fā)生解聚，并使相關(guān)蛋白從染色質(zhì)脫離，因而被廣泛應(yīng)用于鑒定蛋白相分離特性。作者利用1,6-HD處理前后蛋白質(zhì)與染色質(zhì)結(jié)合水平的變化，定義了染色質(zhì)相關(guān)蛋白的抗1,6-HD指數(shù)AICAP（Anti-1,6-HD Index of Chromatin Associated Proteins）。
圖2、 上：AICAP圖示；下：不同的AICAP與蛋白性質(zhì)相關(guān)，相分離蛋白具有較低的AICAP，而組蛋白AICAP接近1
AICAP代表了不同蛋白對1,6-HD處理的敏感性，例如FUS、MED1等蛋白脫離較多，具有較低的AICAP，而組蛋白、SMC-3等結(jié)構(gòu)性蛋白脫離較少，具有較高的AICAP。
為了進一步說明AICAP的生物學意義，作者利用生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)AICAP與蛋白的相分離特性相關(guān)（圖3）。AICAP較低的蛋白，擁有較高比例的內(nèi)在無序區(qū)域（intrinsic disordered regions, IDR）和低復雜度區(qū)域（low complexity domains, LCD），其無序區(qū)域內(nèi)具有較多的疏水氨基酸。AICAP與常用的LLPS預測工具預測結(jié)果吻合，較低AICAP的蛋白具有較高的相分離可能性。并且，已知的亞細胞核結(jié)構(gòu)（nuclear body）組分蛋白具有較低的AICAP。作者還使用了16,-HD的類似物2,5-己二醇（2,5-Hexanediol, 2,5-HD）進行了對照實驗，發(fā)現(xiàn)2,5-HD AICAP與LLPS無上述相關(guān)性，進一步證明了1,6-HD AICAP與LLPS關(guān)系的特異性。通過選取不同AICAP值的7個蛋白，作者進行了細胞內(nèi)熒光漂白恢復實驗，結(jié)果表明流動性較好的蛋白具有較低的AICAP（圖3）。
圖3、 左：AICAP與相分離性質(zhì)吻合；右：流動性高的蛋白具有較低的AICAP
近年來，許多研究表明LLPS可能是染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的形成機制之一，作者為了探究1,6-HD溶解相分離凝聚體對染色三維結(jié)構(gòu)的影響，在1,6-HD處理前后進行了BL-Hi-C實驗。整體而言，與異染色質(zhì)等區(qū)域相比，轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域的染色質(zhì)相互作用對1,6-HD的處理更加敏感。這與參與活躍轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)擁有較低的AICAP相吻合。在染色質(zhì)區(qū)室（compartment）層面上，作者觀察到，A compartment代表的活躍區(qū)域變化較大，而B compartment代表的抑制區(qū)域則相對穩(wěn)定。在拓撲相關(guān)結(jié)構(gòu)域（topologically associated domain, TAD）層面上，結(jié)構(gòu)性蛋白CTCF、SMC3富集的TAD邊界較穩(wěn)定；位于A compartment，缺少足夠CTCF、SMC3結(jié)合的TAD邊界則受影響較大，表現(xiàn)為邊界兩側(cè)的inter-TAD相互作用顯著增加，導致部分TAD邊界消失（15.6%）。染色質(zhì)環(huán)（loop）是更精細尺度的染色質(zhì)相互作用，1,6-HD的處理使大部分（61.5%）的loop減弱甚至消失，尤其是正處于活躍運動階段的DNA loop?？傮w而言，TAD和loop層面的變化與compartment層面的變化一致，并進一步與其相關(guān)蛋白AICAP相一致，即轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域的蛋白結(jié)合以及染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)均對1，6-HD處理更敏感。
圖4 、1,6-HD處理導致染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)變化。左：TAD邊界在處理后被破壞，相鄰TAD間相互作用顯著增加（a，b），CTCF/SMC3富集的TAD受影響較?。╟）；右：染色質(zhì)loop在處理后減弱或消失，DNA stripe（a）是活躍運動的loop，處理后明顯減弱
系統(tǒng)性鑒定、描述生物大分子凝聚體及其組分的實驗方法開發(fā)，對于相分離領(lǐng)域的發(fā)展十分重要。本篇研究中，作者新開發(fā)Hi-MS技術(shù)，結(jié)合Hi-C全方位描述了蛋白質(zhì)水平和基因組水平在相分離凝聚體被1,6-HD溶解后的變化情況。AICAP能定量反映不同蛋白質(zhì)在生理狀態(tài)下對相分離凝聚體破壞的敏感程度，是對熒光漂白恢復和體外重建等現(xiàn)有實驗手段的有效補充。
清華大學醫(yī)學院師明磊助理研究員是本論文的共同第一作者和共同通訊作者，北京大學基礎(chǔ)醫(yī)學院八年制博士生游鎧強為本論文共同第一作者，李婷婷副教授、張奇?zhèn)ソ淌凇㈥愱栄芯繂T為共同通訊作者。清華大學醫(yī)學院沈曉驊教授、李丕龍教授為本論文提供了FRAP實驗所需的熒光蛋白融合表達質(zhì)粒，清華大學醫(yī)學院李海濤教授和生命科學院頡偉教授為本論文提出了寶貴建議。這項工作由國家重點研發(fā)計劃《蛋白質(zhì)機器動態(tài)網(wǎng)絡(luò)的臨界理論和方法研究》 (2017YFA0505503)，國家自然科學基金原創(chuàng)探索計劃《生物分子機器的智能設(shè)計與控制》 (62050152)等項目提供經(jīng)費支持。
參考文獻：
1. Sabari, B. R. et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science 361, eaar3958 (2018).
? ? ? ? 2. Ahn, J. H. et al. Phase separation drives aberrant chromatin looping and cancer development. Nature (2021) doi:10.1038/s41586-021-03662-5.
? ? ? ? 3. Liang, Z. et al. BL-Hi-C is an efficient and sensitive approach for capturing structural and regulatory chromatin interactions. Nat Commun 8, 1622 (2017).
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