馬明團隊利用生物合成和化學修飾制備新穎套索肽類天然產物
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2021年8月10日，北京大學藥學院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室馬明研究團隊在英國皇家化學會旗艦刊《Chemical Science》在線發(fā)表了題為“Rational Generation of Lasso Peptides Based on Biosynthetic Gene Mutations and Site-Selective Chemical Modifications”的研究論文，報道了一類獨特的套索肽天然產物的發(fā)現(xiàn)，以及利用生物合成基因突變和位點選擇性化學修飾制備套索肽衍生物的研究成果。
套索肽（lasso peptides）是一類結構獨特的天然產物，結構中常含有14-33個氨基酸殘基，其N端第1個氨基酸與第7，8或者第9個氨基酸側鏈形成大酰胺環(huán)，而C端的氨基酸穿過此大酰胺環(huán)，形成標志性的“套索”結構。此“套索”結構具有極強的熱穩(wěn)定性和蛋白酶解穩(wěn)定性，因此套索肽被認為是具有理想藥代動力學性質的潛在藥用分子。根據(jù)是否含有二硫鍵以及二硫鍵的連接位置，目前已經發(fā)現(xiàn)四類套索肽。目前發(fā)現(xiàn)的天然套索肽具有抗菌、抗腫瘤、抗HIV等作用；更有意思的是通過生物合成基因突變方式將整合素（integrins）的三肽識別序列Arg-Gly-Asp引入到套索肽MccJ25中后，發(fā)現(xiàn)此MccJ25衍生物具有抑制人臍靜脈內皮細胞血管形成作用。因此，套索肽本身、或者依托套索肽高穩(wěn)定性的骨架綴合藥用功能分子，在先導藥物開發(fā)方面具有廣闊的空間。
圖1. 套索肽的四類結構示意圖和本研究發(fā)現(xiàn)的新穎套索肽stlassin結構
然而，目前套索肽相關研究受到了幾個方面的限制：由于獨特的三維“套索”結構難以化學合成，導致無法像其它肽類化合物那樣用固相多肽合成方法制備化合物庫；套索肽生物合成基因簇常處于沉默狀態(tài)，限制了天然套索肽分子的大量發(fā)現(xiàn)；另外，雖然有針對套索肽生物合成基因簇異源表達（主要在E. coli中）的研究報道，但此類研究大多數(shù)產生的套索肽產量低，無法滿足結構修飾和生物活性測試的要求。
針對上述問題，馬明研究團隊首先從一株海洋鏈霉菌（來自于團隊所構建的海洋細菌菌種庫）中發(fā)現(xiàn)了一個套索肽生物合成基因簇stla，通過將stla克隆至鏈霉菌Streptomyces coelicolor A3(2)中進行異源表達，并引入KasOp*啟動子激活該基因簇，成功發(fā)現(xiàn)一個新穎的II型套索肽stlassin，計算產量可達20 mg/L?；谠摦愒粗苽淦脚_，研究團隊對stlassin生物合成中前體肽中的核心肽（15個氨基酸殘基）開展了點突變，發(fā)現(xiàn)核心肽中15個氨基酸位置的突變對生物合成具有不同的影響；同時得益于異源制備平臺的高產量以及生物合成中翻譯后修飾酶對前體肽突變的容忍性，制備了17個相應的stlassin突變體分子。對stlassin及其變體分子進行了溶液核磁共振結構測定，確證了它們獨特的右手螺旋“套索”結構。同時stlassin及其變體分子顯示了極高的穩(wěn)定性，實驗證實它們可以對抗95 °C加熱以及carboxypeptidase Y的酶解。
圖2. Stlassin及其變體分子的溶液核磁共振三維結構
除了利用生物合成前體肽基因突變獲得stlassin變體分子外，研究團隊還結合近年報道的蛋白/多肽位點選擇性修飾反應，進一步擴展stlassin類分子結構多樣性。通過生物合成前體肽基因突變和高產量異源制備平臺，成功得到了引入酪氨酸或者半胱氨酸殘基的stlassin變體分子。針對引入的酪氨酸或者半胱氨酸側鏈活性基團進行多種溫和條件下的高效修飾反應，制備了10個包含O-糖基化、S-糖基化、S-芳香化、分子內二硫鍵、分子間二硫鍵、硫消除及巰基分子加成等修飾的stlassin變體分子。部分變體分子結構已經超越了目前對套索肽的四種分類范圍。值得注意的是這些修飾反應彌補了生物合成中相應修飾基因缺失的不足，將生物合成制備“套索”骨架與骨架的化學修飾相結合，體現(xiàn)了“源于自然，優(yōu)于自然”的天然產物變體分子制備理念。研究團隊最后對所得stlassin及其變體分子開展了生物活性測試，發(fā)現(xiàn)它們不同程度的抑制脂多糖（LPS）與Toll-like receptor 4 (TLR4)受體的結合，表現(xiàn)出抗炎活性的潛力。
圖3. 生物合成和化學修飾相結合擴展套索肽結構多樣性
該項工作得到科技部重點研發(fā)計劃“深海關鍵技術與裝備”項目“重要深海藥源天然產物合成生物學產生體系構建”、國家自然科學基金委等資助。北京大學藥學院博士研究生劉談、馬曉杰為本論文共同第一作者，中國科學院生物物理研究所蛋白質核磁研究平臺的劉雪輝老師和北京大學藥學院馬明研究員為共同通訊作者。同濟大學韓華老師及楊文盛同學在生物活性測試方面提供了支持。
原文鏈接：https://doi.org/10.1039/D1SC02695J
【通訊作者簡介】
馬明，北京大學藥學院、天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室研究員，博士生導師，Tenure-Track助理教授。研究領域為天然藥用功能分子的生物合成，酶的三維結構及其催化機制，以及天然產物合成生物學。近5年以通訊作者在JACS、Chem. Sci.、Org. Lett.、J. Biol. Chem.、J. Org. Chem.、J. Nat. Prod.、Chin. J. Chem.、Appl. Microbiol. Biotechnol.、ACS Omega、Mar. Drug等國際學術期刊發(fā)表論文十余篇。任中國藥學會海洋藥物專業(yè)委員會委員、中華中醫(yī)藥學會青年委員會委員、北京藥學會天然藥物專業(yè)委員會委員。
天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室 供稿
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