黃碩課題組借助納米孔勢阱實(shí)現(xiàn)低分子量RNA結(jié)構(gòu)解析
RNA是由四種核糖核苷酸以共價(jià)鍵連接而成的線性聚合物，其結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出多樣的變化性，一般存在一級、二級和三級三種結(jié)構(gòu)層次。一級結(jié)構(gòu)是指核糖核苷酸的排列順序，二級結(jié)構(gòu)是指堿基之間非共價(jià)相互作用的二維表示，三級結(jié)構(gòu)是指二維結(jié)構(gòu)單元之間通過非共價(jià)相互作用形成的三維空間結(jié)構(gòu)，包括雙螺旋、吻式結(jié)構(gòu)、假結(jié)結(jié)構(gòu)、核糖拉鏈以及最為經(jīng)典tRNA L型三級結(jié)構(gòu)等。目前對RNA結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的理解是有限的，主要原因是普遍缺乏高分辨率的結(jié)構(gòu)信息。經(jīng)典的結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法如X-ray、NMR或EM往往需要暴力的樣品前處理，容易破壞RNA天然的三級結(jié)構(gòu)。隨著越多越多新的RNA生物學(xué)功能被迅速發(fā)現(xiàn)，迫切需要開發(fā)一種新型溫和的天然RNA三級結(jié)構(gòu)表征方法。
生物納米孔被證明是一種新型的單分子傳感器。該技術(shù)利用分子穿過孔道時(shí)產(chǎn)生的特異性指紋信號進(jìn)行單分子識別，可以分辨細(xì)微的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)差異，同時(shí)兼具無需任何樣品前處理等優(yōu)勢，有望實(shí)現(xiàn)天然狀態(tài)下RNA三級結(jié)構(gòu)的直接檢測。但由于孔徑（1-2 nm）限制，結(jié)構(gòu)化的生物大分子在通過納米孔被檢測的過程中往往需要解折疊成一維線性結(jié)構(gòu)，因而現(xiàn)階段該技術(shù)尚無法直接探測RNA等生物大分子的天然結(jié)構(gòu)。
近日，我院生命分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黃碩課題組報(bào)道了一種新型的納米孔勢阱檢測方法，巧妙地利用錐形結(jié)構(gòu)的恥垢分枝桿菌膜蛋白A(MspA)的寬闊前庭，將復(fù)雜結(jié)構(gòu)的RNA分子捕獲至其納米空腔中，匯報(bào)其空間結(jié)構(gòu)信息。同時(shí)利用孔道狹窄的識別位點(diǎn)匯報(bào)RNA解折疊動力學(xué)信息，以此實(shí)現(xiàn)miRNA, siRNA, tRNA, rRNA等低分子量RNA三級結(jié)構(gòu)的高分辨檢測與區(qū)分。?
圖1: 利用MspA納米孔勢阱區(qū)分低分子量RNA結(jié)構(gòu)?
進(jìn)一步的分子動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)，?tRNA的L型三級結(jié)構(gòu)被MspA捕獲時(shí)存在多種進(jìn)孔構(gòu)型，因此在納米孔傳感中可以匯報(bào)多種特征信號。這表明MspA納米孔勢阱具有高分辨檢測能力，對于幾何不對稱的RNA分子可以匯報(bào)豐富的RNA結(jié)構(gòu)信號。輔助分子動力學(xué)模擬可以對其信號機(jī)制進(jìn)行精準(zhǔn)解讀。?
圖2：分子動力學(xué)模擬揭示tRNA過孔信號機(jī)制
針對這些豐富的RNA特征信號，該工作進(jìn)一步開發(fā)了多參數(shù)機(jī)器學(xué)習(xí)算法，綜合11種特征指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)RNA混合樣本中傳感事件的自動分揀，準(zhǔn)確率高達(dá)93.4%。在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)首次從單分子層面上發(fā)現(xiàn)了tRNA結(jié)構(gòu)的跨物種保守性，并實(shí)現(xiàn)了酵母低分子量RNA的直接檢測。這種基于MspA的納米孔勢阱檢測技術(shù)打破領(lǐng)域內(nèi)納米孔無法檢測大尺寸生物分子的思維定式和技術(shù)瓶頸，為結(jié)構(gòu)化的DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的直接檢測提供新的思路。該工作還為研究RNA-客體分子相互作用，以及理解RNA復(fù)雜的生理功能和RNA疾病相關(guān)研究提供高分辨、免標(biāo)記的單分子分析工具。?
圖3：機(jī)器學(xué)習(xí)輔助的RNA信號自動識別?
該工作以“Structural-profiling of low molecular weight (LMW) RNAs by nanopore trapping/translocation using?Mycobacterium smegmatis?porin A (MspA)”為題，于2021年6月7日在《Nature Communications》發(fā)表相關(guān)論文（DOI：10.1038/s41467-021-23764-y，文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-23764-y）, 我院王玉琴博士后和南京航空航天大學(xué)關(guān)曉宇博士為該論文共同第一作者。我院黃碩教授、南京大學(xué)物理學(xué)院李文飛教授和南京航空航天大學(xué)張道強(qiáng)教授為該論文共同通訊作者。此項(xiàng)研究得到了國家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號：91753108、31972917、21675083、11974173）、江蘇省高層次創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新人才引進(jìn)計(jì)劃（個(gè)人、團(tuán)體計(jì)劃）、江蘇省自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號：BK20200009）、南京大學(xué)優(yōu)秀科研計(jì)劃（項(xiàng)目編號：ZYJH004）、生命分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（項(xiàng)目編號：5431ZZXM1902）、南京大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目和南京大學(xué)高性能計(jì)算研究中心等經(jīng)費(fèi)支持。
版權(quán)與免責(zé)聲明：本網(wǎng)頁的內(nèi)容由收集互聯(lián)網(wǎng)上公開發(fā)布的信息整理獲得。目的在于傳遞信息及分享，并不意味著贊同其觀點(diǎn)或證實(shí)其真實(shí)性，也不構(gòu)成其他建議。僅提供交流平臺，不為其版權(quán)負(fù)責(zé)。如涉及侵權(quán)，請聯(lián)系我們及時(shí)修改或刪除。郵箱：sales@allpeptide.com