顧宏周課題組《Nucleic Acids Research》報(bào)道末端雜交結(jié)構(gòu)促進(jìn)DNA水解自切酶的試管內(nèi)進(jìn)化
?與RNA和蛋白質(zhì)一樣，DNA具備酶的活性，盡管這一特性目前只在體外得到確認(rèn)。在DNA的眾多酶活特性中，可水解切割DNA的DNA（DNA水解自切酶）因其具備作為新型基因編輯工具的潛能受到更多關(guān)注?，F(xiàn)有的DNA水解自切酶都是從人工合成的包含隨機(jī)序列（N）的單鏈（ss）DNA文庫中篩選得到的；大約十年前，耶魯大學(xué)的Breaker團(tuán)隊(duì)建立了一套強(qiáng)大的體外篩選策略，借助環(huán)化酶CircLigase催化線性DNA成環(huán)，從環(huán)形ssDNA文庫中分離出可在DNA骨架任意位點(diǎn)發(fā)生水解自切割的DNA序列（圖1）?；诖瞬呗?，已發(fā)現(xiàn)兩類（I＆II）高活性的特異感應(yīng)Zn離子的DNA水解自切酶，其中I類酶在多項(xiàng)生物技術(shù)的開發(fā)中得到了廣泛應(yīng)用。
圖1. 體外篩選可水解切割DNA的DNA
?2021年5月31日，我院顧宏周團(tuán)隊(duì)在Nucleic Acids Research期刊上發(fā)表題為“New DNA-hydrolyzing DNAs isolated from an ssDNA library carrying a terminal hybridization stem”的工作，通過在ssDNA文庫的末端簡(jiǎn)單地引入互補(bǔ)配對(duì)雜交序列，不僅提升了環(huán)形ssDNA文庫的制備產(chǎn)率（從32%到78%），而且從結(jié)構(gòu)上賦予了文庫更多的功能潛力。在雙重利好的促進(jìn)下，兩類（III&IV）新型DNA水解自切酶序列被體外篩選所揭示。
?環(huán)形ssDNA制備產(chǎn)率的提升可為文庫中的初始序列多樣性提供更好的保障，而末端雜交序列的存在減輕了篩選中DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)化的壓力，這一點(diǎn)反映在III類DNA水解自切酶直接雇傭了末端雜交序列作為其催化中心的關(guān)鍵支撐元素（圖2左）。
圖2. 篩選出的Zn2+依賴型III類DNA水解自切酶在文庫母體序列中的定位和二級(jí)結(jié)構(gòu)（左）以及水解切割位點(diǎn)的確認(rèn)（右）
?研究者發(fā)現(xiàn)III和IV類DNA水解自切酶均特異感應(yīng)鋅離子，各自在特定位點(diǎn)水解切割DNA（圖2右）；兩類酶在中性pH條件下催化DNA水解切割的半衰期約為15分鐘。通過試管內(nèi)退化再進(jìn)化的篩選方式，研究者進(jìn)一步勾勒出這兩類酶的最小二級(jí)結(jié)構(gòu)，并確認(rèn)它們的催化核心均包含約20個(gè)高度保守的核苷酸（圖3）。
圖3. Zn2+依賴型III類和IV類DNA水解自切酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)及保守序列??
?有意思的是，在由兩條序列鏈配對(duì)形成的雙分子構(gòu)建體中，III類酶的保守序列全部集中在被切割的那條DNA鏈上（圖3左）。基于這一特點(diǎn)，研究者展示了可根據(jù)任意目標(biāo)DNA序列（E1&E2），設(shè)計(jì)相應(yīng)的III類DNA探針(S1&S2)，經(jīng)配對(duì)后形成III類DNA酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而觸發(fā)DNA探針序列的自水解切割，實(shí)現(xiàn)對(duì)任意DNA目標(biāo)序列的特異感應(yīng)和檢測(cè)（圖4）。???
圖4.設(shè)計(jì)Zn-III用于潛在的DNA序列檢測(cè)
?總之，該工作進(jìn)一步優(yōu)化了DNA水解自切酶的體外進(jìn)化策略，為篩選依托一系列輔因子的DNA水解自切酶奠定了基礎(chǔ)；該工作同時(shí)揭示了兩類新的鋅離子依賴型的DNA水解自切酶，并展示了DNA水解自切酶在生物傳感檢測(cè)中的應(yīng)用潛力。
?據(jù)悉，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院顧宏周研究員為本文的通訊作者，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院2019級(jí)直博生張燦鈺為本文的第一作者，復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院何云剛青年研究員為本文提供了數(shù)據(jù)分析的支持。
原文鏈接：https://doi.org/10.1093/nar/gkab439
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