鄭鵬課題組結(jié)合點擊化學和酶催化實現(xiàn)高效穩(wěn)定的蛋白質(zhì)固定和單分子測量
蛋白質(zhì)分子的特異性固定和連接在蛋白的研究和應用中發(fā)揮著重要的作用，例如蛋白分子的檢測、抗體偶聯(lián)藥物和單分子研究等。傳統(tǒng)的固定方法常常依賴于雙功能團連接分子，例如帶活化酯基團（N-羥基琥珀酰亞胺，NHS）和馬來酰亞胺基團（Maleimide, Mal）的交聯(lián)劑。其中，NHS可與氨基反應，Mal與蛋白中的巰基反應，從而實現(xiàn)將蛋白質(zhì)的特異性固定于帶有氨基的物質(zhì)上。但是NHS易水解失效不易保存，影響反應的成功率，而Mal可以與蛋白質(zhì)中所有暴露的巰基反應，影響反應的特異性。
為解決這些問題，尋找一種高效穩(wěn)定的蛋白固定方法，南京大學化學化工學院鄭鵬教授課題組最近開發(fā)了一種結(jié)合了應變促進疊氮化物-炔烴環(huán)加成（SPAAC）點擊化學反應和基于OaAEP1 的酶催化連接反應的方法（圖1）。
圖1. 結(jié)合了SPAAC點擊化學反應和酶催化連接反應的方法示意圖
通過該方法，熒光成像結(jié)果顯示eGFP被成功的固定于玻璃片表面（圖2）。單分子力譜結(jié)果顯示肌肉蛋白(I27)8可以固定于玻璃表面且正確折疊（圖3）。在實驗中，該方法的成功率可達~90%，實現(xiàn)了穩(wěn)定的樣品制備。將該方法用于測定SPAAC反應產(chǎn)物的力學穩(wěn)定性，得到其斷裂力大于1.7 nN（圖4）。所以，這種方法不僅實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的高效穩(wěn)定特異性修飾，也可以廣泛應用于蛋白質(zhì)的測量，特別是單分子力譜的研究中。
圖2. 熒光成像表征eGFP被固定于玻璃片表面
圖3. 單分子力譜結(jié)果顯示?(I27)8 的解折疊情況
圖4. 單分子力譜結(jié)果測定SPAAC點擊化學反應產(chǎn)物的斷裂力大于1.7 nN
相關(guān)研究成果以“combination of SPAAC click chemistry and enzymatic ligation for stable and efficient protein immobilization for single-molecule force spectroscopy”為題發(fā)表在CCS Chemistry期刊上（DOI: 10.31635/ccschem.021.202100779）。南京大學2017級博士生時勝超為本文第一作者，鄭鵬教授為通訊作者。該項目在郭子建院士的啟發(fā)和指導下開展，南京大學李劼教授、劉穎教授、葉德舉教授和龐潔老師對項目給予了大力幫助。研究工作得到了南京大學配位化學國家重點實驗室、化學與生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，國家自然科學基金、江蘇省自然科學基金等支持或資助。
版權(quán)與免責聲明：本網(wǎng)頁的內(nèi)容由收集互聯(lián)網(wǎng)上公開發(fā)布的信息整理獲得。目的在于傳遞信息及分享，并不意味著贊同其觀點或證實其真實性，也不構(gòu)成其他建議。僅提供交流平臺，不為其版權(quán)負責。如涉及侵權(quán)，請聯(lián)系我們及時修改或刪除。郵箱：sales@allpeptide.com