蔣爭凡課題組發(fā)現STING活化所需共配體
cGAS是胞質內雙鏈DNA或Mn2+?的受體，也是一個二核苷酸環(huán)化酶，被DNA和/或Mn2+?激活后利用細胞質中的ATP和GTP合成第二信使2’3’-cGAMP?，后者進一步激活STING，最終介導抗病毒/腫瘤免疫反應。而Mn2+?激活的cGAS以一種更高效路徑合成2’3’-cGAMP，Mn2+?單獨使用或與PD-1抗體聯合使用（錳免療法）可顯著增強腫瘤治療效果。cGAMP與STING結合后，STING需要從內質網轉移到高爾基體才能夠被活化。但為什么STING活化必需從內質網轉位至高爾基體一直是領域內懸而未決的重要科學問題。已有的研究表明STING的轉位和激活緊密偶聯：阻斷膜泡運輸的抑制劑BFA可完全阻斷STING的激活，而STING的自激活突變體則會自發(fā)的定位于高爾基體。更加有趣的發(fā)現來源于最近關于COPA綜合征的自身免疫疾病的研究。COPA是負責蛋白從高爾基體向內質網回收的COPI復合體的關鍵亞基，其突變會導致逃逸到高爾基體的STING無法向內質網回收，從而使STING在高爾基體累積并自激活，引發(fā)自身免疫疾病。攜帶COPA突變的細胞中STING的活化完全不依賴于cGAMP，說明定位于高爾基體的STING可自發(fā)活化，并提示高爾基體中存在STING活化所需的未知配體。
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細胞間存在由細胞分泌的蛋白質和多糖構成的細胞外基質。胞外基質不僅為細胞提供支架，還對細胞存活、發(fā)育、遷移、增殖等有重要調控作用。粘多糖是一類在高爾基體合成的、由二糖重復單元構成的直鏈線性聚合物，其主要成分硫酸化糖胺聚糖（sulfated glycosaminoglycans，sGAGs）是胞外基質的重要成員，也是骨基質和結締組織的主要成分?；诙菃卧牟煌M成，可將硫酸化糖胺聚糖分為四大類：①硫酸皮膚素（dermatin sulfate，DS）；②硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）；③硫酸角質素（keratan sulfate，KS）；④硫酸類肝素（heparan sulfate，HS）和肝素（heparin，Hp）。硫酸化糖胺聚糖廣泛分布于細胞外基質，細胞表面或胞內膜泡（高爾基體、內體及分泌小泡）。由于荷載大量帶負電的硫酸化修飾，細胞外硫酸化糖胺聚糖和靶蛋白上正電或極性氨基酸殘基結合，影響受體蛋白與其配體的相互作用或誘導受體寡聚，也被認為是一些膜受體的共配體。近年來的研究發(fā)現粘多糖具有抗凝血、降血脂、抗病毒、抗腫瘤及抗放射等多種藥理活性作用。此外，粘多糖是動物藥的活性成分之一，常見于皮（阿膠、海參、蟬蛻、蛇蛻等），骨（虎骨、狗骨等），角（犀角、鹿茸等），鱗甲（穿山甲、龜板、鱉甲、玳瑁等）及粘液（蝸牛、泥鰍等）等藥材中，這些藥材是我國數千年傳統(tǒng)醫(yī)藥文化的瑰寶。已有的研究表明胞外硫酸化糖胺聚糖在調控很多種生理學功能方面發(fā)揮重要的作用，但胞內硫酸化糖胺聚糖的生理學功能知之甚少，它們參與天然免疫反應的功能從未見報道。
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? 2021年4月14日，生命中心蔣爭凡實驗室在《Immunity》上以research article形式在線發(fā)表了STING為什么需要進行高爾基體轉運的機制研究“Golgi-synthesized sulfated glycosaminoglycans mediate polymerization and activation of the cGAMP sensor STING”，報道高爾基體內合成的硫酸化糖胺聚糖作為STING共配體介導STING在高爾基體的活化。在本研究中，蔣爭凡實驗室的方潤博士和蔣啟飛同學巧妙地利用了STING自激活突變體誘導細胞死亡的特性，在二倍體細胞HT1080中進行了基于CRISPR–Cas9介導的全基因組篩選，發(fā)現多個參與硫酸化糖胺聚糖合成的關鍵基因被高度富集（圖1）。這些粘多糖合成關鍵基因的敲除使細胞喪失了對STING的反應性。隨后，他們通過在不同細胞中構建基因敲除細胞株，進一步證明在高爾基體內發(fā)生的硫酸化糖胺聚糖缺失會嚴重削弱cGAS-STING通路的激活。為了研究硫酸化糖胺聚糖是否直接作用于STING，他們選用了荷載硫酸化糖胺聚糖的核心蛋白SRGN作為硫酸化糖胺聚糖的指針，發(fā)現STING和SRGN存在DNA病毒誘導的共定位和相互作用（圖2A）。用攜帶肝素的磁珠進行體外pull-down實驗也表明STING和肝素存在直接的相互作用，且結合cGAMP的STING具有更強的肝素結合能力（圖2B）。硫酸化糖胺聚糖由于荷載大量帶負電的硫酸化修飾，因而主要通過靜電相互作用與靶蛋白上的正電氨基酸殘基結合來發(fā)揮功能。由于胞內硫酸化糖胺聚糖存在于高爾基體腔內，他們推測位于STING第一和第二跨膜區(qū)之間的三個正電氨基酸殘基（H42，R45，H50）可能參與結合硫酸化糖胺聚糖（圖2C）。將這三個正電氨基酸進行突變會顯著削弱STING的激活（圖2D）。進一步將位于STING第一和第二跨膜區(qū)及第三和第四跨膜區(qū)內的極性氨基酸進行突變則會使STING的活性逐步降低直至完全消失。有意思的是，回復上述三個正電氨基酸中的任意一個都可使完全沒有活性的突變體恢復部分功能。將42位或50位回復為電性更強的賴氨酸或精氨酸，STING的活性會隨著回復的氨基酸的正電荷增多而逐漸增強。有意思的是，在不含有正電氨基酸的第三和第四跨膜區(qū)引入正電氨基酸（P110R）也會部分回復突變STING的活性。免疫共沉淀實驗發(fā)現各種STING突變體與SRGN的相互作用強度和這些突變體的活性有非常一致的相關性；更重要的是，通過引入額外的帶正電的精氨酸（Y46R/H50R，H50R/P110R等）則會使STING組成性地結合硫酸化糖胺聚糖而發(fā)生自激活（圖2E）。這些結果表明硫酸化糖胺聚糖和STING的結合能力是決定STING能否激活及激活強度的決定因素之一。
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為了進一步研究硫酸化糖胺聚糖如何介導STING的激活，他們通過體外實驗發(fā)現多種硫酸化糖胺聚糖可不同程度地誘導STING全長蛋白發(fā)生多聚體化并誘導激酶TBK1的活化，其中硫酸肝素（HS）和肝素（Hp）的激活效果最佳（圖2E）。進一步實驗發(fā)現硫酸化糖胺聚糖激活STING是糖鏈長度依賴的，最短由四個單糖形成的糖鏈即具有激活STING的能力，并且這種激活依賴于糖鏈上的O-位硫酸化修飾。更為重要的是，通過對人、小鼠、蝙蝠和雞四種來源的STING進行分析發(fā)現，硫酸化糖胺聚糖介導STING激活的機制在進化上是高度保守的。最后，他們通過小鼠實驗表明硫酸化糖胺聚糖的合成對于小鼠抵抗DNA病毒感染十分關鍵。
綜上所述，該研究發(fā)現：1）STING活化需要兩種配體。第一種配體是環(huán)化二核苷酸（其中2’3’-cGAMP結合能力最強），與STING細胞質一側的環(huán)化二核苷酸結合區(qū)域結合并導致STING轉位至高爾基體；第二種配體為本研究發(fā)現的高爾基體內sGAGs，與STING高爾基體內一側的正電荷（極性）氨基酸結合，像鉸鏈一樣引發(fā)STING多聚化，進而招募并促進TBK1自磷酸化及下游通路活化（圖3）。2）揭開了“為什么STING必需去高爾基體活化”這一重要的科學謎題，有望打通STING活化的“最后一公里”。3）填補了胞內硫酸化糖胺聚糖的生理學功能研究的空白，揭示了生物多糖在細胞內的關鍵免疫學功能，為未來生物多糖在抗病毒、抗腫瘤的臨床實踐提供新的線索。
北京大學生科院博士后方潤和2015級PTN項目博士生蔣啟飛為該文章的共同第一作者，生命中心/生科院的蔣爭凡為通訊作者。本研究工作得到了生命科學聯合中心、國家自然科學基金委、科技部國家重點基礎研究項目及北京大學“細胞增殖與分化”教育部重點實驗室的資助。
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原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.03.011
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