Cell | 杜鵬課題組揭示通過抑制剪接體捕獲和維持小鼠全能性干細胞
小鼠胚胎發(fā)育由合子開始，經(jīng)過2細胞、4細胞、8細胞和桑椹胚，形成囊胚，之后繼續(xù)發(fā)育形成胚內(nèi)和胚外組織。具有最高潛能的干細胞被稱為全能性干細胞，一般指體內(nèi)的合子，2/4細胞，它可以發(fā)育到胚內(nèi)和胚外組織。多能性干細胞，一般來源于囊胚的內(nèi)細胞團，它的發(fā)育潛能是受限的，只能發(fā)育到胚內(nèi)組織。1981年，人們首次在體外成功分離了第一株小鼠多能性胚胎干細胞系（ESC）。直到40年后的今天，所有培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞都處于多能狀態(tài)，人們一直致力于體外建立發(fā)育潛能更高的干細胞。表達全能性基因Zscan4s和Mervl的2C-like細胞是最早報道的能夠產(chǎn)生胚內(nèi)和胚外組織的細胞[1]。但是，2C-like細胞在培養(yǎng)基中是亞穩(wěn)態(tài)的，僅以極低的百分比（0.1％-1％）存在。2017年，兩個研究小組報道使用不同的化學(xué)小分子混合物建立了擴展型多能干細胞（Expanded (or extended) pluripotent stem cell，EPSC），具有胚內(nèi)和胚外雙向分化潛能?[2, 3]。但是，這種擴展型多能性干細胞的分子特征和功能等方面和體內(nèi)真正的全能性胚胎細胞仍存在較大差距[4]。迄今為止，人們無法在體外捕獲和維持分子和功能上與體內(nèi)全能性胚胎相似的全能性干細胞，因此也就無法真正利用體外細胞培養(yǎng)體系研究著床前胚胎發(fā)育過程，并且導(dǎo)致胚外組織的體外分化及相關(guān)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)應(yīng)用等方面也存在極大的局限性。
2021年5月14日，北京大學(xué)杜鵬課題組在Cell雜志在線發(fā)表了題為“Mouse totipotent stem cells captured and maintained through spliceosomal repression”的研究論文。在這項研究中，作者通過抑制剪接體，實現(xiàn)了小鼠全能性干細胞的體外建立和培養(yǎng)，且這種細胞在分子和功能上接近體內(nèi)2細胞和4細胞時期胚胎，因此被命名為totipotent blastomere-like cells（TBLCs）。
在本研究工作中，作者主要有以下發(fā)現(xiàn)：
1、剪接體抑制驅(qū)動多能干細胞到全能干細胞的轉(zhuǎn)變
作者分析了先前發(fā)表的單細胞胚胎數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)剪接因子在早期胚胎發(fā)育中是動態(tài)變化的，有一類剪接因子在胚胎發(fā)育早期低表達，在后期表達量逐漸升高。作者發(fā)現(xiàn)敲低這一類關(guān)鍵剪接因子能廣泛激活全能性基因（如Zscan4s，Plk2，Btg1/2以及轉(zhuǎn)座子Mervl和Mt2），沉默多能性基因（如Utf1，Tdgf1，Sox2），將小鼠多能性的ESC重編程為全能性狀態(tài)。同時，將剪接抑制劑Pladienolide B（PlaB）添加到Serum/ LIF培養(yǎng)基中（SLP培養(yǎng)基），能夠在體外培養(yǎng)和維持TBLC，且細胞活性和核型正常。與PSCs (pluripotent stem cells) (P0)相比，在SLP培養(yǎng)基中培養(yǎng)5代之后，整體轉(zhuǎn)錄組趨于穩(wěn)定，特異性表達胚胎時期的全能性基因，沉默囊胚時期特異性表達的多能性標(biāo)記基因，接近體內(nèi)胚胎的2細胞和4細胞時期（圖1）。其次他們發(fā)現(xiàn)撤去PlaB后，TBLCs細胞能夠轉(zhuǎn)換到多能性狀態(tài)（圖1），說明單個剪接抑制劑PlaB可以操縱這個多能/全能干細胞轉(zhuǎn)換過程。SLP培養(yǎng)條件提供了一個可靠的體外系統(tǒng)來研究全能到多能細胞的轉(zhuǎn)換，且這個系統(tǒng)在分子水平上能夠模擬從體內(nèi)2細胞時期到囊胚時期的發(fā)育。
圖1 TBLC轉(zhuǎn)錄組穩(wěn)定，且接近體內(nèi)2細胞和4細胞時期胚胎
2、TBLC在單細胞轉(zhuǎn)錄組、翻譯組、DNA甲基化組和染色質(zhì)可及性上具有與2細胞和4細胞時期相似的分子特征
作者首先對PSCs和TBLCs進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序。使用23個多能性標(biāo)記基因和30個全能性基因以及轉(zhuǎn)座子Mervl和Mt2，區(qū)分了PSC和TBLC，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的TBLC來自SLP培養(yǎng)基，說明SLP培養(yǎng)基能培養(yǎng)和維持TBLC細胞的同質(zhì)性（圖2）。此外，翻譯組測序（Ribosomal profiling，Ribo- seq）顯示，與PSCs相比，TBLCs在翻譯組水平上全能性基因表達上調(diào)，多能性標(biāo)記基因表達下調(diào)。作者使用全基因組亞硫酸氫鹽測序法（Whole-Genome Bisulfite Sequencing，WGBS）來表征PSCs和TBLCs的DNA甲基化組，發(fā)現(xiàn)PSCs中的整體甲基化水平為71%，接近E6.5-E7.5時期胚胎；而TBLCs與之相比甲基化水平大幅降低至35%，類似于體內(nèi)2細胞和4細胞胚胎（整體甲基化程度分別為47%和41%）。染色質(zhì)可及性測序ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing）結(jié)果顯示，與PSCs相比，TBLCs在轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）附近的開放峰和封閉峰與小鼠2細胞和4細胞胚胎時期顯示出相似的開放或封閉狀態(tài)，這意味著TBLCs具有與早期胚胎相似的染色質(zhì)可及性。綜上,作者使用單細胞測序以及多組學(xué)分析，表征了與體內(nèi)全能性胚胎相似的TBLCs在轉(zhuǎn)錄組，DNA甲基化組，染色質(zhì)可及性和翻譯組上的分子特征。
圖2 SLP培養(yǎng)基能培養(yǎng)和維持TBLC細胞的同質(zhì)性
3、TBLC與EPSCs和2C-like細胞不同，在分子水平上靠近2細胞和4細胞時期胚胎
此外，作者比較了TBLCs與已發(fā)表的EPSCs和2C-like細胞的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與TBLCs細胞中大多數(shù)多能性標(biāo)記基因被廣泛沉默不同，EPSCs仍明顯表達多能性標(biāo)記基因；而在TBLCs中高表達的全能性基因或轉(zhuǎn)座子在EPSCs中表達量很低。最后，作者對TBLCs和EPSCs與小鼠植入前胚胎數(shù)據(jù)進行了基于轉(zhuǎn)錄組的主成分分析以及與2C-like細胞的相關(guān)性分析（圖3），發(fā)現(xiàn)TBLCs明顯靠近2細胞和4細胞時期胚胎，EPSCs和2C-like細胞接近多能性囊胚時期，這與最近一個研究組得到的結(jié)論一致[4]。
圖3 TBLC與EPSC和2C-like細胞不同，更接近2細胞和4細胞時期胚胎
4、TBLC具有雙向分化潛能，能夠產(chǎn)生多種胚內(nèi)和胚外細胞譜系
作者進行的功能嵌合實驗表明，TBLC具有強大的雙向發(fā)育潛能，可以產(chǎn)生胚內(nèi)和胚外組織，包括囊胚時期的TE，E6.5-E7.5胚胎的EPC和ExE，以及發(fā)育后期的胎盤和卵黃囊。更重要的是，作者還觀察到來源于單個TBLC的熒光標(biāo)記細胞可以嵌合進入整個E6.5-E7.5胚胎，包括EPI，ExE和EPC（圖4）。小鼠胎盤是一個富含血液的復(fù)雜器官，為了避免免疫染色產(chǎn)生的假陽性，作者將E13.5嵌合小鼠的胎盤和卵黃囊消化成單細胞，并通過流式富集篩選出有熒光標(biāo)記的TBLC來源的細胞進行單細胞測序，發(fā)現(xiàn)其能夠在小鼠體內(nèi)分化為至少6種胚外和15種胚內(nèi)細胞類型。本篇文章首次利用單細胞轉(zhuǎn)錄組準(zhǔn)確追蹤出供體細胞的發(fā)育譜系，為全能性細胞的功能性檢驗提供了一個更嚴格的檢驗方法。作者使用單細胞測序，證明了TBLC能夠在胎盤和卵黃囊中分化為至少6種胚外和15種胚內(nèi)細胞類型（圖5）。
圖4 TBLC在E6.5-E7.5的嵌合胚胎中能分化到胚內(nèi)和胚外組織
圖5 單細胞水平上鑒定TBLCs能夠分化到多個胚內(nèi)和胚外細胞譜系
最后，作者發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎干細胞中，動態(tài)剪接體阻遏導(dǎo)致了廣泛的內(nèi)含子積累，從而導(dǎo)致多能性基因表達下降，而全能性基因仍然可以被有效地剪接并激活，這可能與全能性基因擁有短而少的內(nèi)含子的獨特基因特征有關(guān)，但是更詳細的機制還需要繼續(xù)探索。
綜上，此項研究首次建立了體外捕獲和培養(yǎng)全能性干細胞的方法，而且令人驚奇的揭示了剪接體在干細胞命運轉(zhuǎn)變中的重要決定作用。故此，該成果不但對于早期胚胎發(fā)育相關(guān)的基礎(chǔ)研究提供了新的體外研究體系，同時也為未來干細胞相關(guān)的臨床醫(yī)學(xué)研究提供了新型的發(fā)育潛能極高的“種子細胞”來源。
北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心的杜鵬研究員為該論文的通訊作者。北京大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院博士研究生申輝，生命科學(xué)學(xué)院博士研究生楊敏和前沿交叉學(xué)科研究院博士研究生李詩雨為本文的并列第一作者。清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張靜、常在，北京大學(xué)博士研究生彭冰、汪春暉和博士后翁健莉對本文有重要貢獻。該項目得到了國家自然科學(xué)基金、北京大學(xué)“細胞增殖與分化”教育部重點實驗室、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心的資助。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.04.020
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參考文獻：
1 ??Macfarlan, T.S., Gifford, W.D., Driscoll, S., Lettieri, K., Rowe, H.M., Bonanomi, D., Firth, A., Singer, O., Trono, D., and Pfaff, S.L. (2012). Embryonic stem cell potency fluctuates with endogenous retrovirus activity. Nature 487, 57–63.
2 ??Yang, J., Ryan, D.J., Wang, W., Tsang, J.C., Lan, G., Masaki, H., Gao, X., An- tunes, L., Yu, Y., Zhu, Z., et al. (2017a). Establishment of mouse expanded po- tential stem cells. Nature 550, 393–397.
3?? Yang, Y., Liu, B., Xu, J., Wang, J., Wu, J., Shi, C., Xu, Y., Dong, J., Wang, C., Lai, W., et al. (2017b). Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embry- onic and Extraembryonic Potency. Cell 169, 243–257.e25.
4???? Posfai, E., Schell, J.P., Janiszewski, A., Rovic, I., Murray, A., Bradshaw, B., Ya- makawa, T., Pardon, T., El Bakkali, M., Talon, I., et al. (2021). Evaluating toti- potency using criteria of increasing stringency. Nat. Cell Biol. 23, 49–60.
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