? ?神經(jīng)系統(tǒng)實現(xiàn)復(fù)雜行為背后,不同神經(jīng)元之間如何進(jìn)行有效地信息傳遞和整合,以及信息傳遞的異常是否導(dǎo)致特定疾病的發(fā)生,均是神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵問題。乙酰膽堿作為經(jīng)典的神經(jīng)遞質(zhì),是神經(jīng)元之間信息溝通的關(guān)鍵媒介分子,其參與了生長發(fā)育、感知及運動、心血管功能、高級認(rèn)知如學(xué)習(xí)記憶等諸多重要生理功能的調(diào)控1-3。由于神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性和乙酰膽堿的功能多樣性,精確解析乙酰膽堿信號的動態(tài)變化,如特定神經(jīng)元是否在行為的某個階段釋放或接收乙酰膽堿信號,可以幫助我們進(jìn)一步了解乙酰膽堿的生理學(xué)意義。同時,探究乙酰膽堿信號在阿茲海默癥、心血管疾病、腫瘤等疾病中的變化,也有助于探究和解析疾病的發(fā)病機(jī)理或臨床癥狀的成因。
? ?2020年9月28日,北京大學(xué)李毓龍實驗室和北京腦科學(xué)與類腦研究中心井淼實驗室合作,在Nature Methods雜志以Article形式在線發(fā)表了題為“An optimized acetylcholine sensor for monitoring in vivo cholinergic activity”的研究論文,報道了新一代高靈敏乙酰膽堿熒光探針的開發(fā)及其在多種模式生物中的成功應(yīng)用。
? ?應(yīng)用光學(xué)成像的方法檢測乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)在近年來取得了巨大的突破,這主要得利于新型熒光探針的開發(fā)及其廣泛應(yīng)用。自2018年起,北京大學(xué)李毓龍等課題組首次應(yīng)用G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)作為蛋白骨架,構(gòu)建了一系列可以精確檢測神經(jīng)遞質(zhì)動態(tài)變化的熒光探針,即GPCR-Activation Based (GRAB)探針4-7。結(jié)合光學(xué)成像手段,GRAB探針系列目前已在多項工作中成功實現(xiàn)了神經(jīng)遞質(zhì)信號及其功能在活體動物中的進(jìn)一步解析8-10。在本工作中,研究者基于已發(fā)表的第一代GRAB乙酰膽堿探針進(jìn)一步進(jìn)行突變篩選和理性設(shè)計,成功獲得了對乙酰膽堿具有約300%熒光信號響應(yīng)的新版本探針(ACh3.0),其在信號幅度上相比第一代探針有3倍以上的提升,且仍保持著對乙酰膽堿的分子特異性和亞秒級的動力學(xué)特性。更重要的是,通過對探針進(jìn)行設(shè)計和優(yōu)化,ACh3.0探針在結(jié)合乙酰膽堿后不會激活內(nèi)源的信號通路,這使得探針可以安全地作為“檢測器”表達(dá)于細(xì)胞上,而不會對細(xì)胞本身的生理功能帶來影響。綜合而言,新版本的探針在檢測乙酰膽堿方面兼具了細(xì)胞特異性表達(dá)、高靈敏性、高親和力、快速反應(yīng)速率以及高選擇性,這為其在活體內(nèi)精確解析乙酰膽堿的動態(tài)變化奠定了基礎(chǔ)。
圖一:新一代乙酰膽堿探針的開發(fā)及其刻畫。
a: 針對乙酰膽堿探針的關(guān)鍵位置進(jìn)行突變篩選成功獲得新一代探針ACh3.0,其在信號幅度和基礎(chǔ)亮度上都顯著優(yōu)于已發(fā)表的ACh2.0探針。同時,針對受體結(jié)合乙酰膽堿位點的突變獲得對照探針ACh3.0-mut,可在活體應(yīng)用中作為陰性對照證明乙酰膽堿信號的特異性。
b: 不同版本乙酰膽堿探針在培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對乙酰膽堿的熒光響應(yīng)。
? 在對乙酰膽堿探針進(jìn)行優(yōu)化和一系列刻畫后,研究團(tuán)隊進(jìn)一步在多種模式生物中應(yīng)用了探針,并成功地檢測了內(nèi)源的乙酰膽堿在不同腦區(qū)的釋放及其調(diào)控。如在轉(zhuǎn)基因果蠅中研究團(tuán)隊揭示了活體果蠅在接受不同生理刺激時,嗅覺中樞蘑菇體存在區(qū)域特異性的乙酰膽堿釋放。在活體小鼠中,研究者成功記錄到了在包括杏仁核、海馬、皮層等不同腦區(qū)中,多種行為過程中乙酰膽堿的動態(tài)變化,這將對進(jìn)一步研究乙酰膽堿的生理和病理功能提供重要工具。
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圖二:新一代乙酰膽堿探針在果蠅及小鼠中的成功應(yīng)用。
a: 應(yīng)用新一代乙酰膽堿探針ACh3.0觀測到活體果蠅嗅覺中樞中,特定生理刺激引發(fā)的區(qū)域特異性乙酰膽堿信號變化。其中,ACh3.0相比于ACh2.0具有明顯提高的活體檢測靈敏度。
b: 新一代乙酰膽堿探針ACh3.0記錄到小鼠基底外側(cè)杏仁核(BLA)處在小鼠受到電擊刺激時的乙酰膽堿釋放。研究者應(yīng)用對照探針ACh3.0-mut或特異性敲除乙酰膽堿囊泡轉(zhuǎn)運體VAChT的小鼠作為對照,證明檢測到的熒光信號為乙酰膽堿濃度變化導(dǎo)致。
? ?北京腦科學(xué)與類腦研究中心的井淼博士為本文章的第一作者,井淼博士與北京大學(xué)李毓龍博士為文章的共同通訊作者。北京大學(xué)已畢業(yè)本科生李玥璇及CLS項目博士生曾健智、錢統(tǒng)瑞、潘孫磊等對文章做出了重要貢獻(xiàn)。國內(nèi)外合作團(tuán)隊包括中科院神經(jīng)科學(xué)研究所徐敏實驗室、華中科技大學(xué)李浩洪實驗室、北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所陳良怡實驗室和程和平實驗室、加拿大西安大略大學(xué)Marco Prado, Lisa Saksida, Vania Prado和Tim Bussey實驗室,以及美國南加州大學(xué)Andrew Hires實驗室。該研究受到北京大學(xué)膜生物學(xué)重點實驗室、國家自然科學(xué)基金、美國腦計劃、腦科學(xué)與類腦研究北方科學(xué)中心地方配套科研項目、生命科學(xué)聯(lián)合中心等支持。
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10. Zhang, X., Noyes, N.C., Zeng, J., Li, Y. & Davis, R.L. Aversive Training Induces Both Presynaptic and Postsynaptic Suppression in <em>Drosophila</em>. The Journal of Neuroscience 39, 9164-9172 (2019).
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