齊志、李丕龍、黃旭團隊合作揭示FET家族融合致癌蛋白利用相分離提高轉錄的機理研究
轉錄是生命體中最重要的生命活動之一，細胞對于轉錄的調控貫穿著從發(fā)育到衰老的整個過程，而一旦出現(xiàn)異常的轉錄調控，則有可能導致疾病的產生。研究者們很早就發(fā)現(xiàn)細胞核內基因組在轉錄時會有不同區(qū)室產生，有轉錄活躍的區(qū)域，也有轉錄抑制區(qū)域，并且這些區(qū)室在整個生命進程中是動態(tài)性變化的1。有趣的是，生物在進化發(fā)育的過程中出現(xiàn)了很多具有一定功能和組成的無膜結構，關于它們的形成機制一直以來并沒有得到很好的解釋。直到近些年“液液相分離”概念2的引入，才使得人們開始對這些無膜細胞器有了新的認識，這個概念也在幫助人們逐漸認識不同組成不同功能的轉錄聚集體。
FET（FUS/EWSR1/TAF15）融合蛋白可能是眾多參與形成轉錄聚集體的轉錄因子中比較特殊的一部分。FET蛋白家族的成員本身都是RNA結合蛋白，但是在很多肉瘤及白血病患者體內都發(fā)現(xiàn)了由于染色體易位導致的新融合蛋白的形成。在這一類融合蛋白中，N端來自于FET蛋白家族的N端低復雜度結構域（Low complexity domain，LCD），C端主要來自于ETS蛋白家族的DNA結合結構域（DNA binding domain，DBD）。已經有研究表明融合蛋白的N端可以結合RNA聚合酶II（RNA polymerase II, Pol II）的C端結構域（C terminal domain，CTD)，從而提高下游基因的轉錄水平，這可能是癌癥發(fā)生的誘因之一3。2018年Robert Tjian課題組在Science雜志發(fā)表文章，他們在細胞內通過超分辨成像技術觀察到FET家族融合蛋白EWS-FLI1在細胞核中形成聚集體并可以招募RNA聚合酶4。
近日，北京大學前沿交叉學科研究院定量生物學中心、北大-清華生命科學聯(lián)合中心齊志課題組與清華大學生命科學學院李丕龍課題組以及英國格拉斯哥大學黃旭課題組合作在Nature Communications上在線發(fā)表題為Loci specific phase separation of FET fusion proteins promotes gene transcription（FET融合蛋白在特異性靶標位點形成相分離聚集促進下游基因轉錄）的文章。
在該工作中，作者首先體外純化了EWS-FLI1這一被廣泛研究的FET家族融合致癌蛋白，它也是誘發(fā)尤因肉瘤（Ewing Sarcoma）的主要原因之一，以及模式體系FUS-Gal4并證明這兩種蛋白在體外可以和對應的多乘DNA靶標序列形成液態(tài)相分離液滴。然后作者利用最新發(fā)展的單分子生物物理技術 – DNA簾幕（DNA Curtains）對相分離聚集體進行研究。DNA簾幕技術5可以在體外將多個單根DNA分子鉚定在同一條線上，樣品池底部為一層類似于磷脂雙分子層的脂質體，保證了DNA及蛋白在樣品池中的流動性，通過微流系統(tǒng)實現(xiàn)進樣以及改變反應條件，同時這項技術也具備高通量的特點，利用全內反射熒光顯微鏡（Total internal reflection fluorescence microscope, TIRFM）在一次實驗中對多個DNA分子和蛋白分子的運動進行記錄。作者在噬菌體基因組中克隆了一段含有25′ GGAA的微衛(wèi)星序列，通過對EWS-FLI1進行熒光標記，比較靶標位點處熒光強度隨蛋白濃度的變化確定了EWS-FLI1和FUS-Gal4在~100 nM的濃度下就可以在靶標位點處形成具有液態(tài)性質的聚集體，并且靶標位點處形成的聚集體可以招募體外純化的RNA聚合酶II的CTD結構域。之后，作者開發(fā)了一套基于DNA簾幕系統(tǒng)并依賴于FET融合蛋白聚集體體外轉錄的新技術。這個技術的核心想法是將來自于RNA聚合酶II的CTD部分與T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）融合表達并體外純化。當FET融合蛋白在靶標位點處形成聚集體后，T7 RNA聚合酶可通過RNA聚合酶II的CTD與FET融合蛋白N端的相互作用從而被招募到聚集體中起始轉錄。作者利用帶有熒光標記的UTP對轉錄產物RNA進行標記和分析，發(fā)現(xiàn)在多乘靶標位點附近形成的聚集體處的轉錄活性最高，這為FET融合蛋白通過相分離參與調控轉錄活性提供了體外因果性的證明（見圖1）。
圖1. DNA簾幕中依賴于FUS-Gal4融合蛋白聚集體的體外轉錄系統(tǒng)。
?????? 除此之外，作者還通過不同的實驗設計，在DNA簾幕上看到了融合蛋白尋找靶標位點并在含有多乘靶標位點的區(qū)域成核并聚集成液滴的過程，并測得了融合蛋白在發(fā)生聚集后動力學性質的變化，以及靶標序列數(shù)目對融合蛋白相分離強度影響的差異，并提出了DNA序列對相分離液滴形成強度的閾值理論，這些結論可以對相關癌癥的治療提供可能的幫助。
總結一下，本課題利用體外單分子技術系統(tǒng)地研究了FET融合蛋白在特異性靶標位點形成相分離聚集促進下游基因轉錄的分子機制，并用該轉錄系統(tǒng)進一步證明DNA靶標序列的數(shù)量可以對轉錄水平起到調控作用（見圖2）。我們探索出的多乘序列在這一轉錄調控過程中的重要性可以在相關癌癥的治療上提供幫助。
圖2. FET融合蛋白在特異性靶標位點形成相分離聚集促進下游基因轉錄的模型。
北京大學前沿交叉學科研究院定量生物學中心、北大-清華生命科學聯(lián)合中心齊志研究員、清華大學生命學院李丕龍研究員以及格拉斯哥大學黃旭研究員為本文的共同通訊作者。北京大學前沿交叉學科研究院生命科學聯(lián)合中心2016級博士生左琳彧為本文第一作者。清華大學生命學院張冠偉、格拉斯哥大學博士Matthew Massett為本研究做出重要貢獻，同時也感謝北京大學前沿交叉學科研究院定量生物學中心2018級博士生程軍、生命科學聯(lián)合中心2017級博士生郭梓聰、清華大學生命學院王亮博士等同學提供的大力幫助。該研究得到了國家自然科學基金委面上項目、北大-清華生命科學聯(lián)合中心、清華大學高精尖結構中心、以及國家基金委和英國皇家學院共同贊助的國際合作項目的資助。
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原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-21690-7
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參考文獻
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