點(diǎn)孔成金：黃碩團(tuán)隊(duì)《Nature Communications》報(bào)道錐形生物納米孔道內(nèi)構(gòu)建的單原子金反應(yīng)器
在科學(xué)與應(yīng)用領(lǐng)域，金借助其特殊的理化性質(zhì)扮演了不可或缺的角色。首先，金具備極好的延展性、導(dǎo)電導(dǎo)熱性與紅外反射性等優(yōu)越的物理性質(zhì)，因此被廣泛的用作材料的鍍層或被用作電子器件中的導(dǎo)線與觸點(diǎn)。金亦具備獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)，可用作反應(yīng)催化劑或新型藥物的制備。而在近年來興起的納米科學(xué)研究中，金被廣泛應(yīng)用于種類繁多的納米結(jié)構(gòu)和探針的制備。如我們生活中常見的驗(yàn)孕試紙便是使用了膠體形式的金實(shí)現(xiàn)檢測(cè)匯報(bào)。金的三價(jià)化合物氯金酸不僅是納米金的制備前體，也是最常見的金化合物，可以和蛋白質(zhì)乃至核酸堿基產(chǎn)生相互作用。受限于檢測(cè)儀器的時(shí)空分辨率，科研工作者常用的紫外-可見光譜、質(zhì)譜和核磁等表征手段并不適用于在單分子水平上深入探究包括Au(III)化合物在內(nèi)的極小分析物與生物大分子之間的動(dòng)態(tài)相互作用。早期研究表明，氯金酸于水中電離產(chǎn)生的四氯化金離子可以抑制細(xì)胞膜上水通道蛋白的活性，然而其機(jī)理尚未明確（FEBS letters, 2002, 531(3): 443-447）。這就要求我們發(fā)展相應(yīng)的新型分析方法來更加清晰的觀測(cè)這些現(xiàn)象。
生物納米孔技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的單分子研究手段，并已在納米孔核酸測(cè)序領(lǐng)域取得了極為廣泛的關(guān)注。然而生物納米孔之所以能夠?qū)τ诤怂嵘系膯蝹€(gè)堿基實(shí)現(xiàn)分辨，正是源于其超高的動(dòng)態(tài)分辨率，足以分辨小如單個(gè)原子的檢測(cè)分析物。實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過改造的生物納米孔可以直接被用作納米反應(yīng)器，從單分子層面中直接監(jiān)測(cè)化學(xué)反應(yīng)過程。該方向的研究最早可追溯到1997年，英國牛津大學(xué)Hagan Bayley課題組通過設(shè)計(jì)構(gòu)建工程化溶血素(α-HL)納米孔，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Zn2+, Cd2+等金屬離子與氨基酸殘基配位反應(yīng)的單分子觀測(cè)(Chemistry & biology, 1997, 4(7): 497-505.)。但是受限于α-HL孔道的直桶圓柱形識(shí)別位點(diǎn)與較寬的孔體尺度，所有觀測(cè)到的信號(hào)都表現(xiàn)為極微弱的阻塞信號(hào)浮動(dòng)（2-3 pA）。迄今為止，所有的基于生物孔道的單分子反應(yīng)器均由溶血素(α-HL)納米孔構(gòu)建而成。
我院化學(xué)化工學(xué)院黃碩團(tuán)隊(duì)在近期研究探索中意外發(fā)現(xiàn)Au(III)離子可以通過可逆的Au(III)-硫醚配位作用，與野生型α-HL納米孔中的甲硫氨酸殘基(M113)結(jié)合。但正如之前提到的，溶血素對(duì)于金屬離子的檢測(cè)信號(hào)較小，多元離子[AuCl4]-給出電流阻塞信號(hào)也只有5-6 pA，且檢測(cè)信號(hào)具有多種無規(guī)則波動(dòng)，可能來源于Au(III)離子與直筒狀識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)其它氨基酸（如賴氨酸）的非特異性相互作用所致。受到納米孔測(cè)序技術(shù)的啟發(fā)，黃碩團(tuán)隊(duì)通過單個(gè)定點(diǎn)突變，將具有錐形識(shí)別位點(diǎn)的恥垢分枝桿菌孔蛋白A（MspA）納米孔內(nèi)腔中引入了甲硫氨酸，從而將該反應(yīng)有目的的移植到了MspA納米孔最尖銳的識(shí)別位點(diǎn)，即91號(hào)位點(diǎn)處，并觀測(cè)到了對(duì)應(yīng)的單分子反應(yīng)信號(hào)（圖1，動(dòng)圖1）。
圖1： MspA的單個(gè)[AuCl4]-離子傳感信號(hào)。(a).實(shí)驗(yàn)示意圖。(b). Au(III)-硫醚配位的分子模型展示。(c).100 mV下1 μM [AuCl4]-離子的傳感信號(hào)。（圖片來源自該作者）。
動(dòng)圖1：100 mV下MspA的單個(gè)金離子傳感信號(hào)
與α-HL的桶狀構(gòu)型相比，MspA整體呈錐形，其開闊的前庭可以引入更多的離子電流從而放大檢測(cè)信號(hào)，其狹窄的識(shí)別位點(diǎn)則提供了更高的空間分辨率，大大削弱了周圍氨基酸的干擾。在最大檢測(cè)電壓下，該單分子檢測(cè)信號(hào)可以達(dá)到55 pA（圖2）, 也是目前報(bào)道過的最大的納米孔單離子檢測(cè)信號(hào)。
圖2：α-HL和MspA的單個(gè)[AuCl4]-離子信號(hào)比對(duì)。(a). α-HL和MspA的構(gòu)型對(duì)比。α-HL的構(gòu)型為桶狀構(gòu)型，MspA則為錐形構(gòu)型.。(b). 100 mV 下α-HL和MspA的典型 [AuCl4]-離子信號(hào)展示。(c). 200 mV下MspA給出的[AuCl4]-離子信號(hào)。(d) 不同電壓下(20-200 mV) α-HL和MspA的的單個(gè)[AuCl4]-離子堵孔深度比較。（圖片來源自該作者）。
眾所周知，基于生物表達(dá)制備的生物納米孔道只可能形成20種天然氨基酸的空間組合。傳統(tǒng)的定點(diǎn)突變工程無法給生物納米孔到帶來任何氨基酸以外的化學(xué)性質(zhì)。而在單個(gè)金原子鑲嵌孔道內(nèi)時(shí)，MspA納米孔便具備了單個(gè)金原子的化學(xué)特性，形成了一個(gè)金原子內(nèi)嵌的黃金生物孔道，從而獲得了新的傳感功能，并可以直接對(duì)多種生物硫醇如L-半胱氨酸(Cysteine, Cys)，L-高半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)和L-谷胱甘肽(Glutathione, GSH)進(jìn)行單分子區(qū)分。生物硫醇分子具有活潑的巰基官能團(tuán)，可以與[AuCl4]-離子形成更強(qiáng)的Au(III)-硫醇的相互作用，這樣，內(nèi)嵌于孔內(nèi)的金離子，可以作為一座金原子橋，一端連接納米孔上的硫醚，一端連接游離的硫醇分子，從而根據(jù)其獨(dú)特的反應(yīng)中間狀態(tài)匯報(bào)生物硫醇的檢測(cè)信息（圖3，動(dòng)圖2）。該傳感機(jī)制簡(jiǎn)單，無需標(biāo)記，檢測(cè)快速且經(jīng)濟(jì)高效，有希望設(shè)計(jì)為便攜式傳感器芯片用于臨床上的檢測(cè)。并且，Au(III)離子的嵌入可以為其他許多基礎(chǔ)科學(xué)研究項(xiàng)目提高思路，如啟發(fā)藥物分子靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)，或設(shè)計(jì)更多的金屬內(nèi)嵌修飾構(gòu)建一系列金屬生物孔道(Metalloporin)來識(shí)別其它對(duì)應(yīng)分析物，從而拓寬生物納米孔的單分子檢測(cè)功能，并有希望推進(jìn)基于孔道的單分子蛋白質(zhì)測(cè)序研究。
圖3：生物硫醇傳感機(jī)理和對(duì)應(yīng)傳感信號(hào)。(a).生物硫醇傳感機(jī)理的分子模型展示。(b). 半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽的分子結(jié)構(gòu)式及對(duì)應(yīng)的傳感信號(hào)。（圖片來源自該作者）。
動(dòng)圖2：100 mV下MspA中金橋聯(lián)的半胱氨酸傳感信號(hào)
該工作以“Giant single molecule chemistry events observed from a tetrachloroaurate(III) embedded Mycobacterium smegmatis porin A nanopore”為題，于2019年12月11日在《Nature Communications》發(fā)表相關(guān)論文（DOI: 10.1038/s41467-019-13677-2，文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-019-13677-2）。我院化學(xué)化工學(xué)院博士生曹姣為該論文第一作者，黃碩教授為該論文通訊作者。此項(xiàng)研究得到了國家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：91753108、21327902、21675083、31972917）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（國際科技合作促進(jìn)項(xiàng)目）（項(xiàng)目編號(hào)： 020514380142、020514380174）、生命分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（項(xiàng)目編號(hào)：5431ZZXM1804、5431ZZXM1902）、南京大學(xué)卓越計(jì)劃 (項(xiàng)目編號(hào):ZYJH004)、中組部青年海外高層次人才計(jì)劃、江蘇省高層次創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新人才引進(jìn)計(jì)劃和南京大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目等經(jīng)費(fèi)支持。本工作在發(fā)表過程中獲得了我院陳洪淵院士、郭子建院士、趙勁教授、朱少林教授與朱從青教授的諸多寶貴意見。
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