BODIPY染料的母核反應(yīng)：自噬過程中新酸化細(xì)胞器的實時監(jiān)測
自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種自食（Self-eating）的現(xiàn)象。細(xì)胞可以通過自噬和溶酶體，消除、降解和消化受損、變性、衰老和失去功能的細(xì)胞、細(xì)胞器和變性蛋白質(zhì)與核酸等生物大分子。為細(xì)胞的重建、再生和修復(fù)提供必須原料，實現(xiàn)細(xì)胞的再循環(huán)和再利用。自噬在機(jī)體的免疫、感染、炎癥、腫瘤、心血管病、神經(jīng)退行性病的發(fā)病中具有十分重要的作用。新酸化的細(xì)胞器與自噬過程密切相關(guān)，自噬過程本身構(gòu)成了不同代謝途徑的復(fù)雜相互作用。例如，自噬體可以與內(nèi)吞途徑的細(xì)胞器融合（早期/晚期內(nèi)體，多囊體），產(chǎn)生比自噬體更酸性的結(jié)合體。同時，隨著內(nèi)體沿著內(nèi)吞途徑成熟，它們通常變得更酸性（晚期內(nèi)體的pH約為5.0-5.5，早期內(nèi)體的pH約為6.0-6.8）。因此，對細(xì)胞器酸化的實時成像對于更全面地了解自噬過程具有重要意義。標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法是通過電鏡看到膜狀結(jié)構(gòu)的自噬體以及其他相關(guān)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。然而，電子顯微鏡需要化學(xué)固定的死細(xì)胞?；罴?xì)胞成像可通過轉(zhuǎn)染內(nèi)體特異性蛋白基因的方法來實現(xiàn)。但是，這些方法需要相對較長的協(xié)議和復(fù)雜的操作步驟，同時效率低下。已經(jīng)開發(fā)的熒光探針主要用于標(biāo)記長壽命的酸性細(xì)胞器（如溶酶體）。通常遵循的一般策略是設(shè)計在此類細(xì)胞器中積累的探針。但是，這些探針通常不允許追蹤新酸化細(xì)胞器的實際形成。超敏pH納米探針，在研究內(nèi)吞作用和納米顆粒的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)臋C(jī)理研究中可以發(fā)揮重要作用，但是無效的細(xì)胞內(nèi)遞送問題在很大程度上阻礙了它們的應(yīng)用。對于自噬途徑中晚期內(nèi)體和其他酸化細(xì)胞器的標(biāo)記，小分子熒光探針在這里更具前景，因為它們通常具有生物相容性，并且通常具有好的膜滲透性。用于酸性細(xì)胞器的熒光探針通常由具有親脂性、弱堿性的熒光團(tuán)組成，該部分使探針具有親酸性，并在質(zhì)子化時促進(jìn)其在酸性囊泡中的積累。但是，如上所述，該策略不適用于新酸化的細(xì)胞器。當(dāng)細(xì)胞與分子探針一起孵育時，標(biāo)記了長壽命的溶酶體而不是新酸化的細(xì)胞器。這是因為一旦在酸性細(xì)胞室內(nèi)質(zhì)子化，帶凈正電荷的探針就無法輕易穿過細(xì)胞器的膜回到細(xì)胞質(zhì)中。因此，溶酶體外部的探針濃度通常比溶酶體內(nèi)部的探針濃度低一兩個數(shù)量級，從而在實驗過程中無法原位染色新酸化細(xì)胞器。因此，實時監(jiān)測新酸化的細(xì)胞器的關(guān)鍵是將不可見、無熒光形式的分子探針作為“睡眠劑”“走私”到細(xì)胞中，并使它們均勻分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器中，以便“喚醒”，即，當(dāng)細(xì)胞器酸化時會轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N可見的熒光形式。
基于這種設(shè)計思路，南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院配位化學(xué)國家重點實驗室的沈珍教授課題組開發(fā)了一種基于BODIPY母核反應(yīng)的新型熒光探針。通過在BODIPY的3，5-位上修飾了強(qiáng)吸電子基團(tuán)，使得探針的中位碳原子容易受到弱的親核試劑（甲醇或水）進(jìn)攻，導(dǎo)致母體的π共軛度喪失而形成無色且不發(fā)光的leuco-BODIPY形式，在酸性條件下可逆轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袕?qiáng)紅色熒光的BODIPY形式，兩種形式之間的光譜變化超過200 nm。活細(xì)胞成像實驗發(fā)現(xiàn)在酸性細(xì)胞器或酸化的細(xì)胞質(zhì)中顯示出強(qiáng)烈的紅色熒光，而在細(xì)胞的其他區(qū)域則幾乎無熒光。這種快速的可逆變換加上可忽略的細(xì)胞毒性使得探針可以同時進(jìn)行快速、直接的細(xì)胞內(nèi)溶酶體成像和胞質(zhì)酸中毒檢測，且無需任何洗滌步驟，從而能夠在自噬過程中實時監(jiān)測新酸化的細(xì)胞器（圖1）。
該工作以“Real-time monitoring of newly acidified organelles during autophagy enabled by reaction-based BODIPY dyes”為題在線發(fā)表于Communications Biology (DOI：https://doi.org/10.1038/s42003-019-0682-1)，并且被選為封面文章（Featured Image）。南京大學(xué)博士后劉漢壯和博士生宋文婷為本文共同第一作者，南京大學(xué)沈珍教授和德國聯(lián)邦材料與化學(xué)研究所的Knut Rurack博士為共同通訊作者。此研究得到了國家自然科學(xué)基金（21771102）的經(jīng)費(fèi)資助。
圖1. 溶酶體和新酸化細(xì)胞器的探針。 a) BODIPY母核的主要共振結(jié)構(gòu)。 b) CH2Cl2中的BODIPY形式與MeOH中的Leuco-BODIPY形式之間的可逆轉(zhuǎn)化，以及自噬過程中產(chǎn)生的信號傳導(dǎo)應(yīng)答。
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