黃碩團(tuán)隊(duì)iScience: 納米孔錯(cuò)位測序方法NIPSS首次實(shí)現(xiàn)microRNA的單分子直接測序
MicroRNA (miRNA) 是一類長度約為22個(gè)核苷酸（22 nt）的非編碼小分子RNA，其短序列中蘊(yùn)藏著豐富的功能信息，幾乎涉及了生命過程的方方面面，如生長發(fā)育、新陳代謝、病毒感染、免疫反應(yīng)以及腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移等等(Kim et al., 2018)。MiRNA通過堿基互補(bǔ)配對作用靶向mRNA，調(diào)控基因表達(dá)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)這些功能。這一過程中，除了包含A、U、C、G四種經(jīng)典堿基的序列組合，存在于miRNA上的堿基修飾也發(fā)揮著重要的作用。已有研究證明，存在于miRNA的m6A修飾可以影響miRNA的生物合成過程(Alarcon et al., 2015)，并且，其修飾水平的紊亂與胃腸癌密切相關(guān)(Konno et al., 2019)。因此，通過對單個(gè)miRNA分子直接測序來破譯miRNA的序列及修飾信息，可以為理解生命過程及癌癥的診療提供寶貴的信息。
由于miRNA自身長度極短，現(xiàn)有技術(shù)還不能在單分子水平上直接讀取miRNA序列。常規(guī)的miRNA測序方法仍然需要逆轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增的方法間接實(shí)現(xiàn)測序。然而，miRNA的修飾信息會在測序過程中因反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增而丟失，miRNA的直接測序仍是困擾研究者的一大難題，不利于通過測序精準(zhǔn)定位miRNA上的核酸修飾信息，且從原理上無法對單個(gè)miRNA片段上的多種核酸修飾同時(shí)進(jìn)行測序分析。納米孔測序技術(shù)作為新興的單分子測序技術(shù)，無需擴(kuò)增，可以根據(jù)堿基自身的理化性質(zhì)來讀取核酸序列，是最直接的核酸測序檢測方法。然而，現(xiàn)有納米孔測序技術(shù)更多關(guān)注于長讀長的基因組或轉(zhuǎn)錄組的直接測序，對于極短的非編碼RNA的直接測序還沒有相關(guān)報(bào)道。在技術(shù)層面上，現(xiàn)有納米孔測序平臺亦不適用于分析諸如miRNA在內(nèi)的極短非編碼RNA。
近日，我院黃碩教授團(tuán)隊(duì)借助新近研發(fā)的納米孔錯(cuò)位測序技術(shù)（Nanopore Induced Phase-shift Sequencing, NIPSS），首次實(shí)現(xiàn)了miRNA的直接單分子測序，miRNA的序列及修飾信息亦可在測序過程中同步獲?。▓D1）。NIPSS技術(shù)作為近年來黃碩教授團(tuán)隊(duì)原創(chuàng)開發(fā)的新型通用測序方法(Yan et al., 2019)，有別于現(xiàn)有納米孔測序技術(shù)僅能測序基因組或轉(zhuǎn)錄組，NIPSS對任意可以通過孔道的單分子分析物均可實(shí)施直接測序。雖然現(xiàn)有NIPSS測序技術(shù)的讀長僅有15個(gè)堿基（15 nt），但該讀長與天然成熟miRNA的全長（22 nt）極為接近，具有實(shí)現(xiàn)測序檢測的技術(shù)可行性，并在該工作中首次得到了技術(shù)驗(yàn)證。
圖1. NIPSS技術(shù)用于miRNA直接測序方法原理及信號展示。
在該工作中，DNA-miRNA嵌合鏈被用做納米孔測序的模板鏈（圖2）。嵌合鏈可以通過使用T4 RNA連接酶連接待測miRNA 3端和DNA 5端來構(gòu)建。在NIPSS測序過程中，DNA聚合酶合成DNA時(shí)，產(chǎn)生驅(qū)動(dòng)力拉動(dòng)嵌合鏈整體向cis側(cè)移動(dòng)，由于“位差”的存在，其連接的miRNA堿基逐個(gè)通過納米孔識別位點(diǎn)，miRNA序列從而被納米孔直接讀取。原理上說，NIPSS技術(shù)的讀長由聚合酶合成位點(diǎn)與納米孔識別位點(diǎn)之間的“位差”決定，其長度等價(jià)于該工作中所使用的MspA納米孔道的高度，亦對應(yīng)于miRNA 3端的15個(gè)堿基。雖然該讀長不足以完美覆蓋miRNA的全長，基于對現(xiàn)有全部人類miRNA的生物信息學(xué)分析 (http://www.mirbase.org/) ，該讀長足以直接區(qū)分99.5%的人類miRNA，已具備直接的應(yīng)用性。作為概念驗(yàn)證，研究團(tuán)隊(duì)選擇對幾種與腫瘤關(guān)系密切的miRNA進(jìn)行測序，包括致癌性miR-21和其變體miR-21+U (miR-21 3端單尿嘧啶添加產(chǎn)物)，以及抑癌性let-7a。幾種miRNA都給出了與各自序列相對應(yīng)的特征測序信號。序列差異較大的miR-21與let-7a，以及序列高度相似的miR-21與miR-21+U，都實(shí)現(xiàn)了很好的區(qū)分。作為領(lǐng)域內(nèi)的首個(gè)miRNA單分子測序方法，NIPSS技術(shù)展現(xiàn)了高的測序分辨率，這對其應(yīng)用拓展，例如鑒定高序列相似度的miRNA家族成員或單堿基變異，具有直接的檢測價(jià)值。
圖2. NIPSS測序鏈DNA-miRNA的酶連接構(gòu)建原理及結(jié)果表征。其中膠圖中標(biāo)注為DNA-miRNA的明顯條帶為所構(gòu)建的待測嵌合鏈。
在進(jìn)一步的研究中，研究團(tuán)隊(duì)探索了NIPSS技術(shù)表征miRNA上序列修飾的能力。M6A作為一種廣受關(guān)注的RNA 表觀遺傳學(xué)修飾，常見于mRNA。最近的研究表明，m6A修飾也存在于miRNA，并且具有生物學(xué)功能。然而目前還沒有方法能在miRNA序列中定位m6A。在該工作中，研究團(tuán)隊(duì)在miR-21序列中人工引入了單個(gè)m6A修飾堿基（圖3）作為概念性驗(yàn)證，進(jìn)而在NIPSS測序過程中觀測到m6A產(chǎn)生的特異性測序信號。相比于經(jīng)典堿基A，m6A表現(xiàn)出更高的信號特征，從而能在miRNA序列中準(zhǔn)確定位。相較于傳統(tǒng)的二代測序技術(shù)，NIPSS技術(shù)在單分子水平獲取miRNA序列的同時(shí)，序列修飾信息得以保留而被納米孔直接探測，是目前對miRNA修飾信息進(jìn)行直接單分子測序檢測的唯一方法。
圖3. NIPSS技術(shù)用于m6A修飾檢測。
此外，黃碩教授團(tuán)隊(duì)近年來致力于開發(fā)基于納米孔成像技術(shù)的低成本，高通量檢測裝置(Wang et al., 2019)，未來有望與NIPSS測序技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)高通量的miRNA單分子測序。
工作以“Direct microRNA sequencing using Nanopore Induced Phase-shift Sequencing（NIPSS）”為題，發(fā)表在Cell Press旗下交叉學(xué)科期刊iScience上(DOI：https://doi.org/10.1016/j.isci.2020.100916）。我院化學(xué)化工學(xué)院博士生張金月和閻雙紅為該論文共同第一作者，黃碩教授為該論文通訊作者。此項(xiàng)研究得到了國家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號：91753108、21675083、31972917）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（國際科技合作促進(jìn)項(xiàng)目）（項(xiàng)目編號： 020514380142、020514380174）、生命分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（項(xiàng)目編號：5431ZZXM1804、5431ZZXM1902）、南京大學(xué)卓越計(jì)劃 (項(xiàng)目編號:ZYJH004)、中組部青年海外高層次人才計(jì)劃、江蘇省高層次創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新人才引進(jìn)計(jì)劃和南京大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目等經(jīng)費(fèi)支持。
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