北理工在生物傳感器的改造及應(yīng)用方面取得重要研究成果
近日，北京理工大學(xué)生命學(xué)院霍毅欣課題組在異丁醇生物傳感器的改造及應(yīng)用方面取得重要研究成果，并分別發(fā)表于SCI一區(qū)頂級(jí)期刊《Metabolic Engineering》和Q1期刊《Microbial Cell Factories》?！禡etabolic Engineering》論文的第一作者為碩士生蔚歡及博士后陳振婭，通訊作者為霍毅欣教授?！禡icrobial Cell Factories》論文的第一作者為碩士生蔚歡，通訊作者為博士后陳振婭和霍毅欣教授。與此相關(guān)的蛋白純化新方法也發(fā)表于Q2期刊《Journal of Biotechnology》，此論文的第一作者為博士后陳振婭和碩士生趙璐瑤，通訊作者為霍毅欣教授。
異丁醇作為性能優(yōu)異的高級(jí)醇，有望成為新一代運(yùn)輸燃料。然而其生物合成的產(chǎn)量不足以滿足工業(yè)生產(chǎn)需求，因此需要篩選高產(chǎn)的宿主。生物傳感器是合成生物學(xué)中的熱門(mén)元件，通過(guò)設(shè)計(jì)和構(gòu)建生物傳感器，可以使細(xì)胞響應(yīng)自身小分子濃度的變化并輸出便于檢測(cè)的熒光蛋白信號(hào)。生物傳感器結(jié)合FACS技術(shù)是一種簡(jiǎn)單快速，高通量篩選理想表型的有力工具，因而已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于高產(chǎn)菌株篩選和代謝途徑調(diào)控。
北京理工大學(xué)生命學(xué)院的霍毅欣教授課題組針對(duì)異丁醇高產(chǎn)菌株篩選效率低的問(wèn)題，將假單胞菌中烷烴代謝途徑的轉(zhuǎn)錄因子BmoR應(yīng)用于大腸桿菌，以綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因，構(gòu)建了異丁醇生物傳感器系統(tǒng)。隨后，采用了最近興起的ARTP（常溫常壓等離子體誘變）技術(shù)進(jìn)行了宿主突變庫(kù)的構(gòu)建，進(jìn)一步將生物傳感器系統(tǒng)與異丁醇生物合成途徑基因共表達(dá)（圖1），并以綠色熒光信號(hào)篩選到了一株高產(chǎn)菌株。通過(guò)代謝途徑和發(fā)酵條件的優(yōu)化，使其搖瓶產(chǎn)量達(dá)到14 g/L，在生物反應(yīng)器中產(chǎn)量提高至56.5 g/L，為已報(bào)道的最高產(chǎn)量。相關(guān)成果發(fā)表于二區(qū)期刊《Microbial Cell Factories》，原文鏈接：https://doi.org/10.1186/s12934-019-1084-2。
圖1 基于生物傳感器的異丁醇高產(chǎn)菌株篩選
野生型轉(zhuǎn)錄因子通?？梢造`敏地響應(yīng)其信號(hào)分子濃度的變化，從而調(diào)控基因表達(dá)，因此可以用作生物傳感器篩選高產(chǎn)菌株，然而檢測(cè)范圍限制了它們?cè)诠I(yè)生產(chǎn)中的進(jìn)一步應(yīng)用。在前面的研究中發(fā)現(xiàn)，BmoR生物傳感器對(duì)異丁醇的檢測(cè)范圍是0-40 mM（0-3 g/L），在底物濃度達(dá)到40 mM（3 g/L）時(shí)響應(yīng)已經(jīng)達(dá)到了飽和，因此無(wú)法用于鑒別更高產(chǎn)異丁醇的菌株。基于此，該課題組利用蛋白質(zhì)工程的方法對(duì)轉(zhuǎn)錄因子BmoR進(jìn)行了改造，首先通過(guò)易錯(cuò)PCR的方法構(gòu)建了隨機(jī)突變文庫(kù)，并結(jié)合序列比對(duì)，定點(diǎn)突變和飽和突變的方法對(duì)分布在不同區(qū)域的單點(diǎn)突變進(jìn)行了分析（圖2A）。隨后又進(jìn)行BmoR蛋白的結(jié)構(gòu)模擬和底物對(duì)接，推測(cè)了三個(gè)底物異丁醇的結(jié)合位點(diǎn)并進(jìn)行突變驗(yàn)證（圖2B）。最終在單點(diǎn)突變的基礎(chǔ)上構(gòu)建了包含N端和C端兩個(gè)功能域的組合突變，達(dá)到了理想的性能，并通過(guò)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了突變體對(duì)胞內(nèi)異丁醇的響應(yīng)。相比于野生型BmoR，突變體的對(duì)底物異丁醇的檢測(cè)范圍有了明顯的提升（0-100 mM），可以用于篩選7.4 g/L以上的異丁醇高產(chǎn)菌株。該研究既詳細(xì)地解析了BmoR蛋白的結(jié)構(gòu)域和作用機(jī)理，也為轉(zhuǎn)錄因子從生理意義到工業(yè)化應(yīng)用提供了范例。相關(guān)成果發(fā)表于頂級(jí)期刊《Metabolic Engineering》，原文鏈接： https://doi.org/10.1016/j.ymben.2019.08.015。
圖2 轉(zhuǎn)錄因子BmoR的蛋白質(zhì)工程改造
蛋白質(zhì)在生物體中發(fā)揮重要作用，為了探索所需蛋白質(zhì)的特性，蛋白質(zhì)純化是最基本和首要的步驟。另外，在體外酶催化過(guò)程中，酶純化是確保酶純度和提高反應(yīng)速率、降低目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)成本的必要步驟。迄今為止，已經(jīng)建立了各種利用不同標(biāo)簽的蛋白質(zhì)純化方法，包括親和標(biāo)簽、自聚集標(biāo)簽以及自切割標(biāo)簽。但現(xiàn)有的純化方法操作復(fù)雜、成本較高或純化效率低。因此，該課題組開(kāi)發(fā)了一種依賴(lài)于內(nèi)含肽Ssp DnaB和疏水蛋白CipA的新型純化策略。CipA可以自發(fā)組裝成蛋白質(zhì)結(jié)晶包涵體（PCI），Ssp DnaB是一種在弱酸條件下C-端可發(fā)生自切割的小內(nèi)含肽。通過(guò)將Ssp DnaB的C-端融合靶蛋白且N-端融合CipA并使該融合體在大腸桿菌體內(nèi)過(guò)表達(dá)。利用CipA的自聚集特性和內(nèi)含肽的自切割的特性，僅需細(xì)胞破碎，離心和切割步驟即可完成蛋白純化，大大提高了純化效率以及降低成本。該研究首先成功表達(dá)了融合蛋白CipA-DnaB-eGFP，融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)自聚集形成包涵體PCIs（圖3）， 隨后將細(xì)胞破碎并離心后，得到CipA-DnaB-eGFP PCIs沉淀，然后將PCIs沉淀物用pH=6.5的緩沖液重懸使內(nèi)含肽發(fā)生自裂解并釋放eGFP，通過(guò)離心在上清液中得到純化后的可溶eGFP（圖4）。此外，利用此方法又成功純化出MBP，酮異戊酸脫羧酶（Kivd）和醇脫氫酶（AdhP），這種方法有望成為工業(yè)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的有利工具。相關(guān)成果發(fā)表于《Journal of Biotechnology》，原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2019.06.002。
圖3大腸桿菌中CipA-DnaB-eGFP PCIs聚集的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)
圖4 蛋白純化方法的原理圖
附霍毅欣教授簡(jiǎn)介：
霍毅欣教授曾經(jīng)在法國(guó)巴斯德研究所、美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校等歐美科研院校和生物公司學(xué)習(xí)和工作十三年，兼有在學(xué)術(shù)界從事基礎(chǔ)研究和工業(yè)界開(kāi)展應(yīng)用轉(zhuǎn)化研究的經(jīng)歷。2016年起在北京理工大學(xué)組建代謝工程課題組，圍繞著“天然資源的微生物精煉與制造”，以“人工細(xì)胞工廠的設(shè)計(jì)-構(gòu)建-篩選-放大”為主線，以多種模式生物為研究對(duì)象，開(kāi)展了一系列研究，取得了多項(xiàng)研究成果。自2018年以來(lái)以通訊作者或第一作者身份在頂級(jí)期刊Nature Communications（1篇）、Metabolic Engineering（1篇）、Applied Microbiology and Biotechnology（3篇）、Current Opinion in Biotechnology（1篇）及重要期刊ACS Synthetic Biology（1篇）、Microbial Cell Factories（2篇）、Engineering（1篇）、Journal of Biotechnology （1篇）、JoVE（1篇）上發(fā)表論文，申請(qǐng)多項(xiàng)發(fā)明專(zhuān)利。
（審核：周連景）
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