北理工在原核生物基因組編輯技術(shù)的優(yōu)化及應(yīng)用方面取得重要研究成果
近日，北京理工大學(xué)生命學(xué)院霍毅欣課題組在原核生物CRISPR基因組編輯技術(shù)的優(yōu)化及應(yīng)用方面再次取得重要研究成果，并發(fā)表于TOP（頂級）期刊《Applied Microbiology and Biotechnology》。論文的第一作者為2019級博士生黃潮勇，通訊作者為霍毅欣教授，天工所張學(xué)禮和畢昌浩研究員、北理工馬曉焉特別副研究員參與了這項研究。該研究的部分工作在北理工—洛加大蘇州研究院聯(lián)合實驗室完成，項目獲得國家自然基金委面上項目、科技部重點研發(fā)項目、北京理工大學(xué)科技創(chuàng)新項目、以及蘇州工業(yè)園區(qū)的資助。該課題組不久前剛在Q1期刊《Microbial Cell Factories》上發(fā)表相關(guān)領(lǐng)域研究成果，論文的第一作者為2019屆碩士畢業(yè)生張姣，通訊作者為霍毅欣教授；植生所蔣宇研究員參與了這項研究。
CRISPR/Cas9作為新一代基因組編輯技術(shù)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于動物、植物以及微生物的基因組編輯。該技術(shù)利用化膿性鏈球菌來源的Cas9蛋白（SpCas9）產(chǎn)生位點特異性DNA雙鏈斷裂，再通過細胞的同源重組（HR）或非同源末端連接（NHEJ）機制修復(fù)雙鏈斷裂，同時在基因組上引入所需要的突變。與真核生物不同，原核生物普遍難以修復(fù)DNA雙鏈斷裂，絕大多數(shù)細菌缺乏NHEJ系統(tǒng)，而只具有效率很低的HR系統(tǒng)。因此，大多數(shù)研究者選擇將CRISPR/Cas9與重組工程相結(jié)合，通過過表達噬菌體來源的λ-Red系統(tǒng)（一種效率很高的HR系統(tǒng)）幫助原核生物修復(fù)DNA雙鏈斷裂，從而提高編輯效率。與NHEJ介導(dǎo)的基因組編輯相比，HR介導(dǎo)的基因組編輯需要一個供體DNA作為編輯模板，這使基因組編輯操作變得復(fù)雜。研究表明，某些原核生物具有類似真核生物的簡化版NHEJ系統(tǒng)，這些NHEJ系統(tǒng)只需要兩個功能蛋白Ku和LigD。大腸桿菌一直以來被認為缺乏NHEJ系統(tǒng)，近年來，國內(nèi)有研究者將結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌來源的NHEJ系統(tǒng)導(dǎo)入大腸桿菌，成功地開發(fā)出了一種不依賴HR的基因組編輯方法用于快速刪除大腸桿菌基因組序列，大大加速了大腸桿菌遺傳改造的進程。事實上，國外有研究者證明大腸桿菌具有一個類似于NHEJ的末端連接系統(tǒng)（研究者將其命名為A-EJ），該系統(tǒng)的功能蛋白不是Ku和LigD，而是RecBCD和LigA。由于A-EJ修復(fù)DNA雙鏈斷裂的效率遠低于NHEJ，目前還沒有利用A-EJ進行基因組編輯的報道。是否有可能用A-EJ代替NHEJ進行基因組編輯呢？答案是肯定的。
北京理工大學(xué)生命學(xué)院的霍毅欣教授課題組利用David Liu課題組開發(fā)的 xCas9-3.7（SpCas9的進化版突變體）和Jennifer Doudna課題組改造的sgRNA（tracrRNA : crRNA的強化版融合體）構(gòu)建了一個雙質(zhì)粒嚴謹誘導(dǎo)型的基因組編輯系統(tǒng)，并將其命名為CNEE。該系統(tǒng)極為簡單，其功能組件只有Cas9和sgRNA，沒有任何外源的DNA修復(fù)蛋白，利用該系統(tǒng)，即使宿主的DNA修復(fù)系統(tǒng)效率極低，也能高效率地進行基因組編輯。該課題組將CNEE系統(tǒng)導(dǎo)入大腸桿菌，在宿主A-EJ系統(tǒng)的協(xié)助下，實現(xiàn)了高效的基因敲除和長達83 kb的大片段刪除（圖1）。這種方法不需要編輯模板，可以實現(xiàn)快速迭代的大腸桿菌遺傳改造，并且編輯效率不依賴于高轉(zhuǎn)化活性的宿主細胞。由于RecBCD和LigA（或它們的同源基因）在所有的原核生物中都存在，因此理論上CNEE系統(tǒng)適用于任何原核生物的基因組編輯。隨后，該課題組在CNEE的基礎(chǔ)上構(gòu)建了一個變異系統(tǒng)，為了方便描述，暫且把該系統(tǒng)稱為CNEE-V1。將CNEE-V1導(dǎo)入大腸桿菌，可以在宿主RecA同源重組系統(tǒng)的協(xié)助下實現(xiàn)高效精確的基因組編輯，包括序列的刪除、插入和替換。CNEE-V1是對CNEE的有效補充；由于RecA（或它的同源基因）在所有的原核生物中都存在，因此理論上CNEE-V1也適用于任何原核生物的基因組編輯。此外，該課題組還證明，將分枝桿菌來源的NHEJ系統(tǒng)引入CNEE可以進一步增強CNEE的性能；同樣，將噬菌體來源的λ-Red系統(tǒng)可以進一步增強CNEE-V1的性能。相關(guān)成果發(fā)表于TOP（頂級）期刊《Applied Microbiology and Biotechnology》，原文鏈接：https://doi.org/10.1007/s00253-019-10104-w
圖1 基于CNEE的基因組編輯流程
CRISPR/Cpf1是繼CRISPR/Cas9之后被開發(fā)出來的基因組編輯系統(tǒng)。與CRISPR/Cas9相比，CRISPR/Cpf1脫靶率更低且所需的核酸酶和RNA分子更小，因此在基因組編輯領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。然而，編輯效率相對較低限制了CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)的應(yīng)用。谷氨酸棒桿菌是一種重要的工業(yè)生產(chǎn)菌株，此前，研究者利用CRISPR/Cpf1在谷氨酸棒桿菌中進行基因組編輯的效率低于15%，且無法利用線性DNA作為修復(fù)模板。因此，該課題組針對谷氨酸棒桿菌的基因組編輯對CRISPR/Cpf1系統(tǒng)進行了系統(tǒng)的優(yōu)化，優(yōu)化參數(shù)包括PAM序列、間隔序列的長度、修復(fù)模板的類型。利用優(yōu)化后的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在谷氨酸棒桿菌中進行基因組編輯的效率顯著提高，且可以利用線性DNA作為修復(fù)模板。隨后，該課題組利用優(yōu)化后的CRISPR/Cpf1系統(tǒng)對野生型谷氨酸棒桿菌進行遺傳改造，通過敲除基因pyc、ldh和adhA成功地提高了異丁酸的產(chǎn)量（圖2）。相關(guān)成果發(fā)表于《Microbial Cell Factories》，原文鏈接：https://doi.org/10.1186/s12934-019-1109-x
圖2 谷氨酸棒桿菌遺傳改造提高異丁酸產(chǎn)量
霍毅欣教授簡介：
霍毅欣教授本科畢業(yè)于南開大學(xué)，獲北京大學(xué)和巴黎七大雙博士學(xué)位，曾經(jīng)在法國巴斯德研究所、美國加州大學(xué)洛杉磯分校等歐美科研院校和生物公司學(xué)習(xí)和工作十三年，兼有在學(xué)術(shù)界從事基礎(chǔ)研究和工業(yè)界開展應(yīng)用轉(zhuǎn)化研究的經(jīng)歷。2016年起在北京理工大學(xué)組建代謝工程課題組，圍繞著“天然資源的微生物精煉與制造”，以“人工細胞工廠的設(shè)計-構(gòu)建-篩選-放大”為主線，以多種模式生物為研究對象，開展了一系列研究，取得了多項研究成果。自2018年以來以通訊作者或第一作者身份在頂級期刊Nature Communications（1篇）、Metabolic Engineering（1篇）、Applied Microbiology and Biotechnology（4篇）、Current Opinion in Biotechnology（1篇）及重要期刊ACS Synthetic Biology（1篇）、Microbial Cell Factories（2篇）、Engineering（1篇）、Journal of Biotechnology （1篇）、JoVE（1篇）上發(fā)表論文，申請多項發(fā)明專利。
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