黃志偉教授課題組揭示基因編輯系統(tǒng)Cas9變體的底物兼容性和高保真性的分子機(jī)制
近日，生命學(xué)院黃志偉教授課題組通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生化研究手段揭示了SpCas9變體（xCas9 3.7）識(shí)別底物的兼容性和高保真性的分子機(jī)制。該研究成果以《高保真SpCas9變體的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)》（《Structural insights into a high fidelity variant of SpCas9》）為題發(fā)表在《細(xì)胞研究》（Cell Research）雜志上。
CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌編碼的用以防御噬菌體的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過(guò)RNA引導(dǎo)的效應(yīng)蛋白剪切病毒的DNA或者RNA從而抵抗噬菌體（病毒）的感染，其中來(lái)自化膿性鏈球菌(SpCas9）與sgRNA組合具備在細(xì)胞或生物體內(nèi)進(jìn)行高效、便捷“編輯”目的基因的能力，所以近些年來(lái)CRISPR-Cas9系統(tǒng)及其衍生技術(shù)被迅速地應(yīng)用于基因編輯。雖然，CRISPR-Cas9系統(tǒng)作為最廣泛使用的的基因編輯工具被應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的基因編輯，但該系統(tǒng)帶來(lái)的脫靶效應(yīng)和對(duì)識(shí)別底物PAM的限制一直是亟待解決的問(wèn)題。目前通過(guò)對(duì)SpCas9蛋白的篩選，產(chǎn)生了高保真的SpCas9突變體，比如xCas9 3.7(A262T、R324L、S409I、E480K、E543D、M694I、E1219V)，然而SpCas9突變體的高保真結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)一直未知。
為了揭示xCas9 3.7具有廣泛的PAM兼容性和高度DNA靶向特異性的分子機(jī)制，該團(tuán)隊(duì)解析了xCas9 3.7、sgRNA與包含兩種不同PAM的雙鏈DNA的三元復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)E1219通過(guò)鹽橋穩(wěn)定的R1335對(duì)SpCas9嚴(yán)格選擇PAM序列至關(guān)重要，xCas9 3.7中E1219V的突變解除了對(duì)R1335側(cè)鏈的限制，使其具有一定的自由度，從而增加了對(duì)其他底物PAM識(shí)別能力。
xCas9 3.7與野生型（WT）SpCas9相比，盡管兩者整體結(jié)構(gòu)相似，但xCas9 3.7中的REC2和REC3結(jié)構(gòu)域有顯著的構(gòu)象變化，使得和DNA底物的接觸減少，增加了底物識(shí)別的特異性，從而降低了脫靶效應(yīng)?；谶@一研究發(fā)現(xiàn)的機(jī)理，該團(tuán)隊(duì)理性設(shè)計(jì)了一系列SpCas9變體，在生化實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中顯示出新設(shè)計(jì)的突變體與野生型SpCas9相比，具有顯著提高的保真性。該研究不僅第一次揭示了高保真的Cas9基因編輯系統(tǒng)的分子機(jī)制，而且為改造SpCas9以及其他Cas核酸內(nèi)切酶，使之成為更高效、更特異的基因編輯工具提供了關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，具有指導(dǎo)改造新型基因編輯系統(tǒng)的應(yīng)用價(jià)值。這也是該團(tuán)隊(duì)在病原與宿主相互作用系統(tǒng)以及基因編輯系統(tǒng)領(lǐng)域取得的又一研究成果。
黃志偉教授為該論文的通訊作者，該團(tuán)隊(duì)的博士研究生郭明慧、任寬和師資博士后朱玉威為該論文的并列第一作者。上海同步輻射中心為晶體數(shù)據(jù)收集提供了支持。本項(xiàng)目受到國(guó)家自然科學(xué)基金委、哈工大青年科學(xué)家工作室等基金的資助。
文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41422-018-0131-6
版權(quán)與免責(zé)聲明：本網(wǎng)頁(yè)的內(nèi)容由收集互聯(lián)網(wǎng)上公開(kāi)發(fā)布的信息整理獲得。目的在于傳遞信息及分享，并不意味著贊同其觀(guān)點(diǎn)或證實(shí)其真實(shí)性，也不構(gòu)成其他建議。僅提供交流平臺(tái)，不為其版權(quán)負(fù)責(zé)。如涉及侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系我們及時(shí)修改或刪除。郵箱：sales@allpeptide.com