黃志偉教授課題組發(fā)現(xiàn)新型Anti-CRISPR并揭示其抑制Cas12a活性的機制
4月1日，生命學(xué)院黃志偉教授課題組研究發(fā)現(xiàn)了新型Anti-CRISPR蛋白，并揭示其抑制type V型Cas12a活性的新機制。該項成果以《Anti-CRISPR蛋白通過乙酰化修飾type V型Cas12a使之失活》（An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation）為題發(fā)表在《自然結(jié)構(gòu)和分子生物學(xué)》（Nature Structural & Molecular Biology）雜志上，同時該雜志的News & Views欄目作為研究亮點對該成果進行了專題報道。
CRISPR-Cas適應(yīng)性免疫系統(tǒng)為細菌和古細菌對抗噬菌體和質(zhì)粒入侵提供了核酸序列特異性的防御機制。CRISPR-Cas系統(tǒng)分為6個亞型，其中II型Cas9和V 型Cas12a（Cpf1）系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于基因組編輯和多種多樣的生物技術(shù)應(yīng)用。在噬菌體感染細菌過程中，細菌的Cas效應(yīng)蛋白Cas9或Cas12a在RNA指導(dǎo)下通過PAM-interacting （PI）結(jié)構(gòu)域識別位于靶向雙鏈DNA的PAM序列并解旋靶向dsDNA的兩條鏈，從而Cas效應(yīng)蛋白核酸酶結(jié)構(gòu)域切割靶向dsDNA的兩條鏈，抵御噬菌體的入侵。作為對CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)的反擊，噬菌體通過進化出anti-CRISPR蛋白逃逸細菌CRISPR-Cas防御系統(tǒng)。
課題組首先通過生物信息學(xué)方法尋找到一類anti-Cas12a候選蛋白，再通過生化和細菌實驗發(fā)現(xiàn)其中的一個anti-Cas12a蛋白AcrVA5具有抑制Moraxella bovoculi (Mb) Cas12a活性的能力。但意外的是，凝膠遷移實驗發(fā)現(xiàn)AcrVA5蛋白并不結(jié)合MbCas12a-crRNA，這個現(xiàn)象與以前研究發(fā)現(xiàn)的anti-CRISPR蛋白通過結(jié)合Cas蛋白阻止靶向DNA的結(jié)合或者阻止Cas蛋白核酸內(nèi)切酶活性完全不一樣。他們推測MbCas12a的抑制活性可能是通過一種未知的酶修飾而實現(xiàn)的。而通過對AcrVA5蛋白序列分析以及實驗發(fā)現(xiàn)AcrVA5蛋白具有乙?；D(zhuǎn)移酶活性，進一步的生化實驗證實AcrVA5蛋白通過乙酰轉(zhuǎn)移酶活性使得MbCas12a蛋白失活。
課題組進而尋找AcrVA5在MbCas12a蛋白上的乙?；揎椢稽c。這類乙?；D(zhuǎn)移酶通常修飾底物蛋白上的賴氨酸（K）殘基，由于K635是MbCas12a的PI結(jié)構(gòu)域識別底物DNA的PAM序列的關(guān)鍵氨基酸，因此他們推測MbCas12a的K635可能是AcrVA5乙?；揎棌亩Щ畹年P(guān)鍵位點。MbCas12a的K635R突變試驗證實該突變體活性不能被AcrVA5抑制，同時發(fā)現(xiàn)AcrVA5對另一Mb strain（Mb2）的Cas12a（識別PAM序列的關(guān)鍵氨基酸是精氨酸而不是賴氨酸）沒有抑制能力，這些實驗結(jié)果表明AcrVA5蛋白發(fā)揮其抑制作用主要依靠乙?；疌as12a蛋白PAM識別位點的氨基酸K殘基發(fā)揮作用的。有趣的是，Mb2Cas12a的R625K突變體的活性能夠完全被AcrVA5抑制，該結(jié)果結(jié)合質(zhì)譜分析從而證實AcrVA5蛋白通過修飾MbCas12a蛋白的識別底物PAM的關(guān)鍵K635殘基使之失活。而Cas12a蛋白的結(jié)構(gòu)揭示K635的乙?；粌H使dT2和dA（3*）之間失去氫鍵相互作用，也可能形成空間位阻，阻止了dsDNA的結(jié)合，從而使Cas12a失去dsDNA切割活性。
該研究揭示的anti-CRISPR通過乙酰轉(zhuǎn)移酶活性修飾并抑制CRISPR蛋白的機制和該課題組以前發(fā)現(xiàn)的anti-Cas9的抑制機制完全不一樣，anti-Cas9是通過直接結(jié)合Cas9的底物結(jié)合位點從而抑制Cas9的活性。該研究首次揭示了anti-CRISPR蛋白可以通過酶修飾作用抑制細菌CRISPR-Cas免疫防御系統(tǒng)的新機制和策略，為噬菌體和細菌免疫系統(tǒng)（CRISPR-Cas）之間的進攻防御策略提供了新觀點。該發(fā)現(xiàn)可以用于在體內(nèi)精確控制Cas12a的活性，提高基因編輯的精確性。這也是該團隊在病原與宿主相互作用和基因編輯分子機制研究領(lǐng)域取得的又一重要研究成果。
黃志偉教授為該研究論文的通訊作者，博士研究生董立永和關(guān)曉宇，北京大學(xué)高寧組的李寧寧博士為該論文的并列第一作者。張帆副教授、朱玉威博士對該研究做出了重要貢獻。上海同步輻射中心為晶體數(shù)據(jù)收集提供了支持。本項目受到國家自然科學(xué)基金委、哈工大青年科學(xué)家工作室等基金的資助。
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https://www.nature.com/articles/s41594-019-0206-1
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