上海交大生命科學技術(shù)學院科研團隊在中鏈脂肪酸合成硫酯酶的定向設(shè)計方面取得新進展
近日，國際代謝工程領(lǐng)域重要學術(shù)期刊《Metabolic engineering》在線發(fā)表上海交通大學生命科學技術(shù)學院科研團隊最新研究成果“Structure-guided Reshaping of the Acyl Binding Pocket of ‘TesA Thioesterase Enhances Octanoic Acid Production in E. coli”。上海交通大學博士生鄧茜為第一作者，馮雁教授和楊廣宇研究員為共同通訊作者。
?；滈L為六到十個碳原子的中鏈脂肪酸（MCFAs, C6–C10）及衍生物具有獨特的應(yīng)用價值。與長鏈組分相比，中鏈烷烴/烯烴及脂肪酸酯更適合用來替代汽油等現(xiàn)有化石燃料；中鏈脂肪酸還具有抗菌、免疫調(diào)控等效果，使相關(guān)衍生物廣泛應(yīng)用于食品、藥物生產(chǎn)中。近年來脂肪酸的微生物合成取得了許多進展，但產(chǎn)物中應(yīng)用價值更高的中鏈脂肪酸含量仍然較低。硫酯酶是脂肪酸合成過程中鏈長控制的關(guān)鍵酶，對硫酯酶進行底物選擇性的定向設(shè)計是提高中鏈脂肪酸合成能力的關(guān)鍵。
大腸桿菌硫酯酶‘TesA（去除N端信號肽）是II型脂肪酸合成途徑中應(yīng)用最廣泛的硫酯酶，但該酶底物選擇性寬泛，合成中鏈脂肪酸的能力較弱。研究小組聚焦‘TesA?；Y(jié)合口袋，預(yù)測與底物結(jié)合密切相關(guān)的熱點殘基；采用半理性設(shè)計（定點飽和突變和活性中心飽和測試）策略，利用酯酶底物acyl-pNP進行突變庫的高通量篩選、脂肪酸合成途徑真實底物acyl-ACP對優(yōu)異突變體進行底物選擇性表征，獲得的最優(yōu)突變體RD-2（M141L/E142D/Y145G/L146K）對中鏈底物C8-ACP的活性和選擇性比野生型分別提高了8倍和133倍。將最優(yōu)突變體基因引入到脂肪酸合成工程菌中，所獲工程菌的辛酸產(chǎn)量比野生型提高10倍，在5-L發(fā)酵罐中辛酸產(chǎn)量達2.7 g/L，是目前大腸桿菌II型脂肪酸途徑報道的最高辛酸滴度。
研究小組還解析了選擇性發(fā)生明顯轉(zhuǎn)變突變體的晶體結(jié)構(gòu)。通過結(jié)構(gòu)比較及動力學模擬分析，發(fā)現(xiàn)突變體?；Y(jié)合口袋底部139–145區(qū)域的顯著構(gòu)象變化重塑了口袋形狀，同時口袋中部出現(xiàn)明顯的連續(xù)疏水界面。底物對接結(jié)果表明，連續(xù)疏水界面提高了突變體對中鏈底物的親和性，而重塑的?；Y(jié)合口袋使長鏈底物處于扭曲狀態(tài)，不利于酶與底物的結(jié)合，從而降低對長鏈底物的催化活性。研究首次證實了‘TesA 硫酯酶?；Y(jié)合口袋重塑與疏水性提高驅(qū)動了突變體底物選擇性的重大轉(zhuǎn)變，將為進一步改造SGNH家族硫酯酶提供有力指導。
該研究建立并成功實施了針對硫酯酶底物選擇性的半理性設(shè)計策略，揭示了‘TesA硫酯酶loop運動重塑催化口袋的新機制，為其他硫酯酶的分子改造提供了重要指導，有望進一步促進微生物細胞工廠的中鏈脂肪酸合成能力。
該研究項目獲得科技部（2017YFE0103300）和國家自然科學基金（31570788,31670791及21627812）的資助。
論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ymben.2020.04.010
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