Cell Stem Cell | 湯富酬課題組與合作者建立人類精子發(fā)生過程高精度轉錄組圖譜
人類精子發(fā)生過程承載著將父源基因組遺傳信息進行精準代際傳遞的任務，也是人類自身繁育和物種延續(xù)的重要保障。全世界約有10-15%的育齡夫婦存在不孕不育的問題，其中，男性因素約占50%左右。闡明人類精子發(fā)生過程中的基因表達調控機制是發(fā)育生物學的重大科學問題，對理解、診斷和治療男性不育相關疾病至關重要。
2018年8月30日，北京大學北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、生命科學學院BIOPIC中心湯富酬課題組，北京大學第三醫(yī)院喬杰課題組和南方醫(yī)科大學趙小陽課題組，聯(lián)合在國際知名學術期刊《Cell Stem Cell》上在線發(fā)表了題為“Single-Cell RNA Sequencing Analysis Reveals Sequential Cell Fate Transition during Human Spermatogenesis”的研究論文。首次從單細胞水平系統(tǒng)闡明了人類精子發(fā)生過程中的基因表達調控網絡和細胞命運轉變路徑，繪制了人類精子發(fā)生的高精度單細胞轉錄組圖譜，解析了成年男性全部生殖細胞類型及其關鍵的分子標記，并初步探索了將單細胞轉錄組技術用于人類非梗阻性無精癥的研究和診斷。
研究團隊首先分離并獲取了正常成年男性和梗阻性無精癥患者的2,854個睪丸組織細胞，對其進行了高精度的單細胞轉錄組測序分析，并結合t-SNE、PCA和Monocle2等多種生物信息學分析方法對這些數據進行深度挖掘，在國際上首次完成了人類精子發(fā)生過程中的細胞命運轉變和基因表達圖譜的繪制。在此基礎上，研究團隊進一步對一例非梗阻性無精癥患者的174個睪丸細胞進行研究，確定了該無精癥患者睪丸中的各種細胞類型及其與正常人睪丸中對應的細胞類型相比發(fā)生的基因表達異常，為男性不育的臨床診斷提供了新的思路。
1. 人類精子發(fā)生過程中的細胞命運轉變和基因表達動態(tài)
該研究選取臨床捐獻的成年男性睪丸組織為材料，通過隨機挑選或流式分選兩種策略獲取睪丸組織的單細胞樣品，隨后進行高精度單細胞轉錄組測序，并借助計算生物學方法對單細胞轉錄組數據進行深度挖掘（圖1a）。經過非監(jiān)督聚類分析，發(fā)現在2,854個睪丸細胞中共存在17種不同的細胞類型，其中14種為各個分化階段的睪丸生殖細胞，另外3種為睪丸微環(huán)境體細胞（圖1b）。利用眾多特異的標志基因對所有細胞類型進行身份鑒定，最終確定出3種精原細胞，包括精原干細胞（SSC）、分化中的精原細胞（Diff.ing SPG）、分化后的精原細胞（Diff.ed SPG）；7種精母細胞，包括3種細線期精母細胞（L1~L3）、偶線期精母細胞（Z）、粗線期精母細胞（P）、雙線期精母細胞（D）、分裂期初級精母細胞及次級精母細胞（SPC7）；以及4種精子細胞（S1~S4）（圖1c）。通過Monocle2對人類精子發(fā)生過程進行擬時間發(fā)育分析，發(fā)現由以上14種生殖細胞構成的發(fā)育路徑與經典的生精上皮發(fā)育過程高度吻合（圖1d）。至此，該研究首次借助高精度單細胞轉錄組測序技術完整地描繪了人類精子發(fā)生過程中細胞命運轉變的精確過程和基因表達變化的動態(tài)圖譜，為進一步深度解析人類精子的發(fā)生過程奠定了重要的研究基礎。
圖1：人類精子發(fā)生的單細胞轉錄組圖譜（a）研究流程示意圖；（b）17類睪丸細胞轉錄組的t-SNE分析圖；（c）人類生精過程中標志基因的動態(tài)表達變化圖；（d）人類睪丸生殖細胞的擬時間發(fā)育圖
2. 人類精原細胞的自我更新、分化及參與的信號通路
基于t-SNE分析，該研究發(fā)現了3種人類精原細胞類型，通過分析細胞類型特異的標志基因在3種精原細胞類型中的表達特征，發(fā)現精原干細胞高度富集了與自我更新調控相關的GFRA1、RET以及與干性維持相關的SALL4、UTF1等關鍵基因；而進入到下一個發(fā)育階段（分化中的精原細胞），DMRT1、KIT等與精原分化相關的基因開始富集；最終在分化后的精原細胞中，減數分裂啟動的標志分子STRA8開始高表達，標志著人類精原細胞正式啟動減數分裂（圖2a）。除了經典的RET信號通路，該研究發(fā)現并且驗證了BMPR1B與FGFR3為人類精原干細胞特異性表達的標志分子，也首次在精原干細胞中發(fā)現BMP與FGF信號通路從配體、受體到效應分子均呈現高度富集的特點（圖2b，2c），這一結果表明，BMP和FGF信號通路很可能在人類精原干細胞的自我更新過程中發(fā)揮了關鍵作用。
圖2：精原細胞的基因表達調控（a）精原細胞階段特異標志基因的表達熱圖；（b）睪丸組織BMPR1B、FGFR3的RNA原位雜交與DDX4的免疫熒光染色定位；（c）BMP、FGF信號通路關鍵基因的表達熱圖
3. 人類精母細胞的基因表達特征
精原細胞進入減數分裂并發(fā)育為各級精母細胞，在細線期與偶線期，同源重組相關基因DMC1、SPO11與聯(lián)會復合體組分SYCP1、SYCP3、SYCE1等高度富集（圖3a），表明該階段正在高度有序地發(fā)生同源重組與同源染色體聯(lián)會等重要的生物學事件，以確保減數分裂的正確發(fā)生。隨著粗線期（P）同源染色體配對與聯(lián)會的完成，聯(lián)會復合體逐漸在雙線期（D）開始解體，隨后初級精母細胞進入分裂期，進而一分為二產生2個次級精母細胞（SPC7）。由于分裂期初級精母細胞與次級精母細胞發(fā)育進程非常短暫，其基因表達特征鮮有報道。在該研究中，通過對各級精母細胞的基因表達特征進行精細分析，并結合CCNA1/2、頂體素酶原（ACR）、γH2AX、DDX4等的表達特征（圖3a，3b），首次實現了對人類分裂期初級精母細胞與次級精母細胞的身份確認，并確定了其整體水平上的基因表達特征。
圖3：精母細胞的基因表達調控（a）精母細胞階段特異標志基因的表達熱圖；（b）ACR、TJP3的表達圖；（c）CCNA1/2、PNA、γH2AX和DDX4在SPC7中的表達特征
4. 人類精子細胞的發(fā)育及其調控機制
1個四倍體的初級精母細胞會產生2個二倍體的次級精母細胞，并最終產生4個單倍體的精子細胞。隨后，精子細胞需要經過魚精蛋白轉換、細胞質脫落、鞭毛生成等一系列的重要生物學變化，最終成為可游動的成熟精子。在整體轉錄水平上，精子細胞從第一個階段（S1）到第四個階段（S4）呈現轉錄本總量逐漸下降的趨勢，這表明精子成熟過程伴隨著基因表達整體水平的降低。該研究發(fā)現精子細胞階段表達的基因可細分為4個類別，包括2類轉錄下調的基因，1類轉錄先上調而后下調的基因，以及1類表達上調的基因（圖4a）。對這4類基因的深入研究將有助于我們了解人類精子成熟的調控機制。
通過單細胞轉錄組分析，研究團隊發(fā)現人類精子細胞可分為四種類型（S1~S4）。進一步通過DDX4、TNP1、PRM1、PNA等標志分子的蛋白表達特征，證實人類睪丸中存在上述四種精子細胞類型（圖4b，4c）。
圖4：精子成熟過程的基因表達調控（a）與人類精子細胞成熟相關的4類基因；（b）精子細胞階段特異標志基因的表達熱圖；（c）DDX4、TNP1、PRM1、PNA在人類精子細胞中的表達特征
5. 人類睪丸的體細胞微環(huán)境
t-SNE分析發(fā)現人類睪丸中的體細胞主要分為三大類：支持細胞（ST）、MIX細胞、以及睪丸巨噬細胞（tMφ）。支持細胞中高度富集視黃酸合成相關基因（ALDH1A1），視黃酸通過旁分泌途徑誘導精原細胞表達STRA8，使其進入減數分裂（圖5a）。而MIX細胞在基因表達水平上存在較大的異質性，通過t-SNE對MIX進行重新分群，發(fā)現MIX包含表達INSL3、DLK1的間質細胞和表達MYH11、ACTA2的管周肌樣細胞（圖5b）。免疫熒光定位檢測證實了人類睪丸組織中的體細胞微環(huán)境主要由支持細胞、間質細胞、管周肌樣細胞和睪丸巨噬細胞共同形成（圖5c）。人類睪丸體細胞主要參與性激素合成、減數分裂的啟動、細胞間的粘附與遷移，以及睪丸內的免疫反應，尤其是睪丸巨噬細胞，這類很少被關注到的細胞類型將為探索人類睪丸微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持提供新的研究思路。
圖5：睪丸體細胞的基因表達調控（a）人類睪丸體細胞標志基因的表達熱圖；（b）利用t-SNE對MIX進行重新分群，以及兩個亞群中INSL3、DLK1、 MYH11和ACTA2的表達特征；（c）免疫熒光染色證實人類睪丸中存在4類體細胞
6. 單細胞轉錄組用于確定非梗阻性無精癥患者的睪丸細胞類型和基因表達特征
人類睪丸的單細胞轉錄組圖譜的繪制，使研究者對非梗阻性無精癥的深入研究成為可能。通過對一例非梗阻性無精癥患者的174個睪丸細胞的單細胞轉錄組分析，發(fā)現這些細胞主要聚類到睪丸體細胞類型中的支持細胞和MIX細胞，對該例非梗阻性無精癥患者的體細胞差異表達基因進行分析，發(fā)現了包括BEX1、FATE1在內的一系列可能與該疾病發(fā)生相關的差異基因（圖6b，6c）。利用Gene Ontology（GO）對差異基因進行分析后發(fā)現，非梗阻性無精癥患者的體細胞中高度富集細胞凋亡、氧化應激等生物學過程（圖6d）。隨后，免疫熒光染色結果證實了該例非梗阻性無精癥患者睪丸組織中細胞凋亡表征明顯。通過對該例無精癥的探索，建立了基于單細胞轉錄組分析的無精癥分子診斷平臺，為研究不育癥致病機制和臨床診斷提供了新的思路。
圖6：無精癥睪丸細胞的基因表達調控（a）生精上皮完整男性的2,854個睪丸細胞及NOA患者的174個睪丸細胞組成的t-SNE圖；（b）NOA患者與生精上皮完整男性支持細胞的差異基因火山圖；（c）NOA患者與生精上皮完整男性MIX細胞的差異基因火山圖；（d）NOA患者的睪丸體細胞上調基因中富集的生物學過程
綜上，該研究在國際上首次成功繪制了人類精子發(fā)生的高精度單細胞轉錄組圖譜，為人類精子發(fā)生、減數分裂調控機制的研究、無精癥的分子診斷和臨床治療提供了全新的視角。
北京大學博士生柳溪溪、陳依東，南方醫(yī)科大學汪妹博士，深圳大學常港博士，以及廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院安庚博士為該論文的并列第一作者，北京大學湯富酬教授、喬杰教授、和南方醫(yī)科大學趙小陽教授為該論文的共同通訊作者。此項工作得到國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、廣東省科技計劃、北京未來基因診斷高精尖創(chuàng)新中心、以及中國博士后基金的支持。
原文鏈接：https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(18)30392-8
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