定向合成代謝加速天然產(chǎn)物挖掘新進(jìn)程
近日，代謝工程領(lǐng)域頂級期刊《代謝工程》（IF：8.201）在線發(fā)表我院鄧子新院士團(tuán)隊(duì)劉天罡教授課題組的最新研究成果，題為《高效的萜類化合物底物供給平臺助力釋放萜類環(huán)化酶生物合成潛力》（Releasing the potential power of terpene synthases by a robust precursor supply platform）。這是該課題組近年來在該期刊發(fā)表的系統(tǒng)性研究成果之一，也是劉天罡教授提出“定向合成代謝”（Targeted Synthetic Metabolism）理論技術(shù)體系的又一突破性成果。
該項(xiàng)研究成果將合成生物學(xué)和代謝工程的應(yīng)用范圍拓展到天然產(chǎn)物挖掘領(lǐng)域，使得萜類骨架化合物及其生物合成元件的挖掘速度取得了突破性的進(jìn)展，同時(shí)也使得人們對萜類環(huán)化酶合成能力的認(rèn)識提升到一個(gè)新的高度，具有廣泛的應(yīng)用性。該研究工作主要由博士生卞光凱和武漢臻智生物科技有限公司工程師韓以超等完成，劉天罡教授為論文通訊作者。
圖1.?組合生物合成策略指導(dǎo)的具有底物及反應(yīng)雜泛性萜類環(huán)化酶及新（骨架）產(chǎn)物的高效挖掘
圖2.?酶的理性改造加速萜類化合物挖掘進(jìn)程
萜類化合物是最重要一類天然產(chǎn)物，著名的青蒿素和紫杉醇都屬于這一家族。目前，人們對萜類化合物生物合成相關(guān)元件的挖掘還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。其中，萜類環(huán)化酶（terpene cyclase）能夠催化不同鏈長的異戊二烯單元合成單環(huán)或者多環(huán)的萜類化合物核心骨架，是萜類化合物結(jié)構(gòu)多樣性的基礎(chǔ)，挖掘新的萜類環(huán)化酶成為拓展萜類化合物結(jié)構(gòu)多樣性的一個(gè)決定性步驟。傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物挖掘方法通常受限于自身或異源表達(dá)宿主的產(chǎn)物合成能力，僅能對其中主要的產(chǎn)物進(jìn)行挖掘鑒定，這在很大程度上掩蓋了這些萜類環(huán)化酶的生物合成潛力。因此，開發(fā)一個(gè)高效的萜類化合物生物合成元件及其產(chǎn)物挖掘平臺，是加速萜類化合物相關(guān)研究進(jìn)程的關(guān)鍵所在。
劉天罡教授課題組對絲狀真菌來源的I型萜類環(huán)化酶進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)第三個(gè)（clade III）進(jìn)化分支上的萜類環(huán)化酶具有底物及反應(yīng)雜泛性（promiscuous）的潛質(zhì)。他們對絲狀真菌Fusarium graminearum?J1-012基因組中的萜類環(huán)化酶進(jìn)行生物信息學(xué)分析，在第三個(gè)進(jìn)化分支中挖掘到兩個(gè)潛在的具有底物及反應(yīng)雜泛性的萜類環(huán)化酶FgMS和FgGS。體外反應(yīng)結(jié)果顯示，這兩個(gè)酶具有空前的底物和反應(yīng)雜泛性，能夠以香葉基焦磷酸（GPP）、法尼基焦磷酸（FPP）、香葉基香葉基焦磷酸（GGPP）以及香葉基法尼基焦磷酸（GFPP）為底物合成多種類型的萜類化合物。隨后，他們在前期對萜類化合物“定向合成代謝”深刻認(rèn)識的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一個(gè)含有3個(gè)不同模塊（底物供給模塊、不同異戊二烯前體模塊、萜類合酶模塊）的萜類化合物組合生物合成平臺，研究這兩個(gè)酶合成萜類化合物的潛力。結(jié)果表明，這樣能夠合成多達(dá)50種單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜化合物。對其中的12個(gè)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定并從中篩選出7個(gè)新的二萜和二倍半萜化合物，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新骨架化合物，顯示出FgMS和FgGS這兩個(gè)酶強(qiáng)大的萜類化合物合成能力以及該組合生物合成平臺的高效性。
為進(jìn)一步增加產(chǎn)物的多樣性，加速萜類化合物挖掘進(jìn)程，該課題組對其中的FgMS進(jìn)行同源建模，并對其活性口袋附近潛在的非保守氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行分析及定點(diǎn)突變。體外研究結(jié)果顯示，F65L和F159G能夠合成6個(gè)潛在的新的二倍半萜化合物，可豐富有限的二倍半萜化合物骨架的數(shù)量。再對其中1個(gè)主要產(chǎn)物進(jìn)行發(fā)酵、純化并鑒定，發(fā)現(xiàn)其為新的二倍半萜類化合物。這一組合生物合成結(jié)合酶的理性改造策略，使得我們能夠充分挖掘FgMS和FgGS的生物合成潛力，相較于傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物挖掘手段，發(fā)現(xiàn)新（骨架）化合物的數(shù)量和效率得到了極大的提升。
此后，課題組又對通用蛋白數(shù)據(jù)庫（UniProt）中真菌來源的I型萜類環(huán)化酶進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，從中篩選得到321個(gè)位于第三個(gè)進(jìn)化分支的萜類環(huán)化酶，為后續(xù)這類具有底物及反應(yīng)雜泛性萜類環(huán)化酶及新產(chǎn)物的挖掘指明了方向。這將極大地加速新的萜類化合物生物合成元件及產(chǎn)物的挖掘進(jìn)程，還可以快速推廣到其它天然產(chǎn)物的挖掘進(jìn)程中去，有望顛覆傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物挖掘方式。
論文鏈接：http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717617300472
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